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第一章
绪论
1细胞工程:应用细胞生物学和分子生物学的理论、方法和技术，按人的设计，有计划地大规模培养组织或细胞以获得生物产品，或改变细胞的遗传物质以产生新的物种或品系。
2生物工程:也称生物工艺学,一般称为生物技术.是以生命科学为基础,利用生物体系和工程学原理来获得生物制品和创造新物种的一门综合技术。
生物工程的发展历史
传统生物工程:利用非纯种微生物自然发酵工艺为标志的生物技术，如酿酒。
1857，Pasteur L发现发酵是微生物作用的结果，而后形成的采用纯种微生物的发酵工艺。
近代生物工程：以抗生素工业的兴起为标志。
现代生物工程：1973基因工程和1975年单克隆抗体技术建立为标志的生物工艺。
生物工程的组成一、发酵工程
二、酶工程
三、细胞工程
四、基因工程
五、蛋白质工程
六、生化工程 一，发酵工程
1现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。
现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。
2一般发酵工程包括以下基本步骤：（1）菌种选育；
（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性产物的诱导；（4）菌体及产物的收获
3发酵工程的产品范围非常广泛。
从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料等等，生物可降解塑料PHB等
四，基因工程
1基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。2 稀少珍贵的蛋白质药物
1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品——人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。
人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-
2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等 3畜牧业中的应用
动物疫苗、生长激素等
例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA 4种植业中的应用 用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物 抗化学除草剂基因，转基因西红柿，固氮酶基因„„
环境保护等等
五，蛋白质工程：利用生物技术手段，对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获得自然界没有的具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质技术。
蛋白质工程的主要步骤通常包括：
（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；
（2）测定其氨基酸序列；
（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；
（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。
六，生化工程
生物化学工程是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，主要研究将生物技术的实验室成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题。
细胞工程的分类
1、根据研究对象划分：微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程。
2、根据研究水平划分：组织水平、细胞水平、细胞器水平、基因水平。
细胞工程主要研究内容
1）植物细胞和组织培养技术
2）动物细胞和组织培养技术
3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）
4）细胞器移植技术
5）染色体工程技术
6）胚胎工程技术
第三章
植物组织培养
第一节 植物组织培养
植物组织培养的基本概念
植物组织培养的应用 1.无性系快速繁殖
2.去除病毒、真菌和细菌等病毒 3.培育新品种的得力手段 4.种质资源的保存 5.次生代谢物的生产
植物组织培养的基本流程
脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程即形成愈伤组织叫脱分化。愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。再分化：愈伤组织内的细胞具有异质性，能重新分化成各种类型的组织细胞。
植物组织培养的理论依据（1）细胞全能性
全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。
植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，（2）细胞分化
在体内维管组织是高度分化的部分，主要受生长素和蔗糖的影响，木质部的分化与细胞分裂素、赤霉素和细胞分裂相关。
在体外的培养细胞通过茎芽的分化或细胞胚胎发生能再生长成为完整的植株
第二节 植物细胞培养
1所谓细胞培养,是指在离体条件下,将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养,得到分散成游离的悬浮细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量细胞群体的一种技术.2.与植物组织培养的区别
细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长,此时细胞不在生长成组织.对于植物,组织培养主要是指我们常用的快繁技术,而细胞培养主要有以生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术.植物单细胞培养技术 一.单细胞的分离
１.由植物器官分离单细胞
（１）机械法
主要通过机械磨碎.切割植物体从而获得游离的单细胞．
（２）酶解法
这种方法是目前最为有效的一种获得单细胞的方法，主要是利用果胶酶的处理，获得大量的细胞． ２.由愈伤组织获得单细胞
该方法通过愈伤组织培养获得愈伤组织，并通过培养使愈伤组织增殖．由于愈伤组织细胞之间的结构非常疏散，因此可以通过高频率振动使细胞脱落，从而获得单细胞．
二.单细胞培养方法
（１）平板培养法:指将制备好的单细胞，按照一定的密度，接种在约１mm厚的薄层固体培养基上进行培养的方法．
（２）看护培养法:
指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞的方法
（３）饲养层培养法
指用处理过的无活性的或者分裂很慢.不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长．
（４）液体浅层静置培养法
将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养．
（５）细胞悬浮培养法
主要指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下进行培养
悬浮细胞同步化的方法
（一）物理方法
1、体积选择法
2、冷处理法
（二）化学方法
1、饥饿法
2、抑制法
3、有丝分裂法
细胞的保存
１.继代培养保存法
每隔1—2周换液进行一次继代培养 ２.低温保存法
5—10℃培养,每10天换液 ３.冰冻保存
原生质体的分离和培养
原生质体定义：植物除去细胞壁分离剥下的部分 来源:叶片,根尖,愈伤组织.一，原生质体的分离
1）机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割
2）酶解法
二，.原生质体鉴定与活力测定
(一)原生质体鉴定
1.低渗爆破法
2.荧光染色法
(二)原生质体活力测定
1.渗透压法
2.氧电极法
3.二乙酸荧光法(FDA)三，原生质体培养方法
1.液体培养法
2.固体培养法
3.双层培养法
在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液培养原生质体
四，原生质体的发育和植株的再生
1.细胞壁再生
2.分裂
3.愈伤组织的形成 4.植株再生
3.3植物器官培养
植物器官培养：指将植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。主要包括：毛状根，芽，体细胞胚等
3.31植物脱毒培养技术
如何在一个已经受感染的群体中获得无病植株？
a.种子繁殖
b.消除病原菌 消除病原菌的方法
a.热处理：热水或热空气。b.茎尖培养。c.愈伤组织培养。
3.32 体细胞胚胎发生
体细胞胚：在离体或活体条件下，由除受精卵之外的体细胞形成的胚。体细胞胚胎发生的过程
1、取植物的一部分组织(如根、茎、叶的切段或胚等)，用组织培养的方法，分裂产生愈伤组织，这个阶段一般采用固体培养方法。通常所采用的脱分化试剂是2,4-D，有的植物除2,4-D以外，还需要附加少量的细胞分裂素。至于2,4-D的浓度，则因植物而异，一般宜采用较高的浓度。外植体的年龄也很重要，一般幼龄的较容易产生愈伤组织。
2、用所得的愈伤组织进行悬浮培养，使细胞分散。
3、将悬浮培养物倒在没有植物激素的固体平面培养基上，再进行固体培养，其中有些胚性细胞就有可能发生体细胞胚。
3.33 人工种子
利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子，用以繁殖遗传工程植物，自交不亲合植物，稀有植物，远缘杂交种等
人工种皮：藻酸钠 人工种皮的选择: 1)对所要包埋的胚乳无伤害。
2)有足够的柔软性,可以保护胚乳,并允许其发育.3)具有一定的硬度,避免运输.操作过程中的伤害.4)具有穿透性,传递细胞生长所需的营养;并能容纳其他附加成分。5)可以用现有的温室或农机机械进行播种。
海藻酸盐具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性极低、成本低廉等特点。
人工种子的包埋方法
1.复合凝聚：两种带相反电荷的电解质在水中相互作用形成多聚体包被溶液.2.界面聚合：在两相界面处因溶解度低而成膜.3.离子交换凝胶：经过离子交换而形成络合物成为凝胶.4.变温凝胶：高温下为液体，低温下为固体凝胶。
3.4植物细胞的生物反应器大规模培养
生物反应器培养（培养方法和各自特点）
1、分批培养：一次性添加培养液培养，期间不更换培养液。是一种封闭式的培养体系。
2、半连续培养：在培养过程中将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。
3、连续培养法：在培养过程中不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养液，使培养物不断补充并保持其恒定体积的培养。
目前生物反应器主要分为以下三种：
机械搅拌式、鼓泡式、气升循环式
植物细胞两相培养技术
如何使细胞内的次生代谢产物分泌出来并加以提取分离是降低成本、进行连续培养的关键。两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移至有机相中。
可以减少产物的反馈抑制作用从而提高产物含量；通过有机相的不断回收及循环使用实现培养的连续化。
植物细胞固定化方法
1、海藻酸盐固定化
2、卡拉胶固定化
3、琼脂糖固定化
4、琼脂固定化
植物细胞固定化生物反应器培养
1、流化床生物反应器
2、填充床生物反应器
3、膜生物反应器
第四章
动物组织培养
1、连接方式：
（1）紧密连接
（2）间隙连接：质膜间有2—3nm的间隙
（3）隔壁连接：20--30nm的间隔，有横隔
（4）中间连接： 20--30nm无横隔的透明区
（5）桥粒连接
动物细胞与组织培养的定义
定义：是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术 体外培养分为原代培养和传代培养
原代培养指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程
传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养
体外培养的细胞根据生长方式分为
1、贴附型细胞
（1）成纤维细胞型细胞
（2）上皮型细胞（3）游走型细胞
（4）多形型细胞
2、非帖附型细胞
动物细胞体外培养的特点
（1）哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长
（2）动物细胞对营养要求更加苛刻
（3）对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感
（4）动物细胞生长缓慢，培养时间较长
（5）动物细胞培养还需要防治污染问题 培养工具：无毒塑料制成的培养瓶、培养皿
载体：空心纤维和微珠 培养条件
（1）温度：最适温度37℃
（2）PH：最适PH7.2—7.4
（3）气体
（4）营养：①天然培养基
②合成培养基 ③无血清培养基
④动物细胞培养必需的溶液
动物细胞培养必需的溶液
1、平衡盐水
2、培养基PH调整液
3、细胞消化液
4、抗生素溶液
培养液中加入适量的抗生素，可以预防由于操作不慎而产生的微生物污染。
青、链霉素:青霉素能抑制细菌细胞壁的合成;链霉素能抑制细菌蛋白质的合成.卡那霉素:卡那霉素也能抑制细菌蛋白质的合成.制霉菌素:干扰细菌细胞质膜的合成.体外培养细胞的生长与增殖过程
（1）原代培养期：1—4周（2）传代期：10—50次
（3）衰退期
动物细胞培养的传统方法
（1）悬滴培养法
（2）旋转管培养法（3）灌注小室培养法
（4）培养瓶培养法（5）培养板培养法
生长特
①游离期
②吸附期：平均时间5－20分钟
③繁殖期：接触抑制
④退化期：轮廓变强，细胞内有膨胀的线粒体颗粒堆积
动物细胞大规模培养技术
（1）气升式深层培养系统
（2）悬浮培养技术
（3）微载体培养系统
（4）多孔载体培养
（5）微囊化培养技术
（6）中空纤维培养法
组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后种植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术
器官培养：取出动物器官或进一步修整成器官型植块，将其接种到培养基上或培养液中，在适当的营养、气相、生长基质等条件下使其存活或生长的技术
第五章
细胞融合与单克隆抗体
第一节
细胞融合 定义：又称体细胞杂交.指用自然或人工方法,使两个或更多个不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。细胞融合的意义
1、用于遗传性状的改良。
2、克服远缘杂交中的不亲和障碍。
3、可以更加广泛的组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。
细胞融合技术
为了使制备好的原生质体或细胞能融合在一起，选择适宜有效的诱导融合方法很重要。诱导融合方法可分为：
1、仙台病毒法
2、PEG（聚乙二醇）诱导法
3、电融合诱导法
一，生物法——仙台病毒法
仙台病毒也称日本血凝病毒，是RNA病毒，多呈颗粒状，由于被感染细胞表面发生某些改变，使得这些细胞容易发生融合，甚至处死的仙台病毒也具有促进细胞融合的作用。
仙台病毒具有促使凝结的细胞发生融合的能力，这是因为各种能被其作用的细胞均有相应受体的缘故。现已基本知道，其促进细胞融合的有效部位在于它的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。
病毒促使细胞融合的主要步骤如下
1、两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼 此靠近。
2、通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间相互渗透，胞质互相渗透。
3、两个原生质体的细胞核互相融合，融为一 体。
4、进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。
二、PEG（聚乙二醇）诱导法
原理：由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。
PEG诱导融合的特点
1）其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
2）PEG可能对细胞有毒害。
三、电融合诱导法 电融合的基本过程：
1）细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
2）膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。优点：
1、融合率高，达70％－80％，甚至100％。
2、不存在对细胞的毒害问题。
3、融合技术操作简便。
融合细胞的选择
1、遗传互补筛选法
2、抗性互补筛选法
3、利用物理特性筛选法
4、利用生长特性筛选法
1、遗传互补筛选法
利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。
如：亲本1：叶绿体缺陷型
亲本2：光致死型
两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。
2、抗性互补筛选法
利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。
如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能生长
亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长
杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡。
3、利用物理特性筛选法
根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。
亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体
亲本2：叶肉细胞原生质体
在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分。
4、利用生长特性筛选法
利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。
例如：粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。
第二节单克隆抗体
抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。
特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。
单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
单抗的制备过程 动物免疫与亲本细胞的选择 细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 3 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等 5 杂交瘤细胞的克隆化培养 6 单克隆抗体的大量制备
一、亲本细胞的选择
骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶）。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。
三，HAT选择系统
HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。
杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。
含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。
淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。
杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。
在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。
单抗的大规模生产
1、利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。
2、体内接种杂交瘤细胞，制备血清或腹水 1）实体瘤法：
对数生长期的杂交瘤细胞按1-3×107个/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml。待肿瘤达到一定大小后（一般10-20天）则可采血，从血清中获得单抗含量可达1－10mg/ml，但采血量有限。2）腹水的制备
将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。
方法是将异十八烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种1×106 个 杂交瘤细胞。10-20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含5-20mg单抗。
第六章
染色体工程
染色体工程: 是在细胞遗传学研究的基础上,利用已在染色体上标记的基因, 人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术。
第一节 人工诱导多倍体
常见多倍体有三、四、五、六和八倍体。
多倍体产生的途径
1、原种或杂种所形成的未减数配子的受精结合2、原种或杂种的合子的染色体加倍 染色体加倍的技术方法
1、生物学方法
生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。
例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。
这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导致第二极体不排出，而产生多倍体
2、物理学方法
温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。
定义：用略高于(冷休克)或略低于(热休克)致死温度来诱导三倍体或四倍体的方法。
关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。
优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。
水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。
这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。
但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。
高盐高碱法:高盐高碱法是近几年才尝试使用的方法,采用高PH值或高盐条件来诱导产生多倍体.3、化学方法
有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。
细胞松弛素B能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂,常用于动物多倍体诱导。
秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。
PEG是一种常见的细胞融合剂.用PEG处理虹鳟精子,使精子细胞融合后,再与卵子受精,也可获得三倍体.其它药物还有麻醉剂，如N2O、和聚乙二醇等。
缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。第二节 人工诱导雌、雄核发育
雌核发育:俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。
赫特威氏效应:指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却能起到激活卵球启动发育的作用。
雌核发育的关键问题..要达到二倍体雌核发育目的，必须解决两个最主要的问题。第一：人为地使精子的遗传物质失活； 第二：阻止雌性个体染色体数目的减少。
染色体转移又称为染色体转导，是指把同特定基因表达有关的染色体或染色体片段取转入受体细胞，使之表达，并能在细胞分裂中一代一代传递下去的技术。
微细胞：是指含有一条或几条染色体（即只含有一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体
微细胞介导的基因转移法 方法：
1、微细胞的制备
用化学试剂阻断供体细胞的有丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期，从而在染色体周围逐渐形成核膜而形成众多的微核。然后在细胞松弛素B的作用下使微核逐渐突出细胞膜外，最后经过离心获得含有一个微核、四周有一薄层细胞质和质膜界限的微细胞
2、微细胞融合与细胞融合方法相同
第七章 胚胎工程
胚胎工程（embryo engineering）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。
胚胎工程的意义
1、发挥优良母畜的繁殖潜力
2、促进家畜改良的速度
3、作为胚胎操作的基础
4、保存遗传资源
精子的成熟和获能
精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能，才具有使卵受精的能力。
在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋白，称为去获能因子，精液中的精子表面被覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生一系列变化。
早期胚胎发育
卵裂：合子发生分裂形成无数小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。
桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名 胚胎发育
胚泡：哺乳动物的胚胎处于16细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。
囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层
原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。
7.2配子操作 采卵(方法)1输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。
2对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。
3.对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。
4.对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。
体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。
胚胎操作
1胚胎培养
2胚胎移植
3胚胎保存
4胚胎分割
5胚胎嵌合 培养方法
即微滴培养法、输卵管培养法和中间受体培养法。
微滴培养法是利用塑料平皿制成50μl培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到5％CO2、95％空气饱和湿度的37.5℃CO2培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。
输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。中间受体培养法是指，将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。同期发情
胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情（oestrus ynchronization），包括自然同期发情和人工同期发情。
自然同期发情即不经任何药物处理，依靠动物自身的性周期规律，选择处于适当时期的母畜作为受体。
胚胎移植
移植分为手术移植和非手术移植，胚胎保存
保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。
非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法。
胚胎分割的原理
根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。
胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。
嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态
发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为次生性嵌合体
植入前胚胎嵌合体的制作方法
聚合法
第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5％链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有5μg/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作用，更易聚合。若放到37℃时，效果更佳，聚合完毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。
第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。
第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。
囊胚注射法
第八章
细胞重组与克隆技术
细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种试验技术 细胞重组的方式：
1、胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种
2、微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体
3、胞质体与核体重新组合形成重组体
细胞重组技术
（一）显微操纵术
（二）细胞分离技术
1、梯度沉降分离法
2、等密度沉降分离法
3、流式细胞仪分离法
（三）细胞破碎方法
1、超声波破碎法
2、反复冻融法
3、化学裂解法
4、高速组织捣碎法
（四）细胞器的分离
（五）胞质体、核体和微细胞的制备
克隆的技术方法
（一）细胞核移植
细胞核移植技术是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术
（二）核移植技术一般操作程序
1、核受体细胞的准备（1）卵母细胞的来源（2）核受体细胞的去核
2、核供体细胞的准备（1）核供体细胞的要求
（2）核供体的种类：胚胎卵裂球和体细胞
3、细胞核移植
胞质内注射和透明带下注射
4、激活
电刺激和化学试剂法（乙醇、DMAP）
5、重组胚的体内或体外培养
6、胚胎移植
克隆动物一般制备技术
1、胚胎细胞核移植法
2、胚胎干细胞核移植
3、胎儿成纤维细胞核移植
第九章
转基因生物与生物反应器
几种有效的转基因方法
一物理方法1电穿孔法
2、微注射法
3、裸露DNA直接注射法
4、基因枪介导的DNA转移 二，化学方法
1、DEAE－葡聚糖法
2、DNA-磷酸钙沉淀法
3、脂质体（liposome）介导的基因转移 三，生物学方法 病毒介导的基因转移
病毒载体包括：
DNA病毒载体
反转录病毒载体
