半保留复制实验证明_半保留复制的论述证明

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半保留复制实验证明 Watson和Crick在他们发表在1953年4月25日的Nature上的具有划时代意义的题为“Molecular structure of Nucleic Acids”论文的最后一段这样写道：“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a poible copying mechanism for the genetic material.The structure itself suggested that each strand could separate and act as a template for a new strand,therefore doubling the amount of DNA, yet keeping the genetic information,in the form of the original sequence,intact.”翻译成中文的意思是，“特定的碱基配对性质让我们立刻注意到遗传物质可能的复制机制。结构(双螺旋)的本身意味着每一条链可以分离开来，作为新链的模板，于是DNA的量加倍了，而且保证了遗传物质以原封不动的序列形式存在。”在文中，他们虽然并没有提及DNA复制的具体机制，但已经就DNA复制的可能采取的是一种半保留方式做了大胆的预测。然而，细胞内DNA复制是不是就是以这种方式进行的，光凭预测是不够的，还必须用实验去验证。由Meselson和Stahl(图32－50)设计的被誉为生物学最美丽的实验“the most beautiful experiment in biology”最终证明了Watson和Crick预测的正确性。

1953年，Meselson在加州理工学院(Caltech)开始了以化学为专业的研究生阶段的学习。他进了Pauling的实验室，最终完成了其博士论文第二个阶段关于N,N-二甲基丙二酰胺(N，N-dimethyl malonamide,)晶体结构的工作。这部分工作的重点是确定这个分子中含有的肽键是不是共平面的，即是否与Pauling的共振理论相符。与他的博士论文的第一个部分关于大分子的密度梯度平衡沉降技术在DNA研究上的应用相比，这一部分鲜为人知。身为Pauling的弟子，在听过Pauling开设的有关化学键的课程以后，他对当H被其同位素氚(2H)取代以后氢键的相对强度产生了兴趣。就在他对氚参入到生物分子以后，生物体如何能够生存下来的问题发生兴趣的时刻，Meselson正好去听了Jacques Monod在Caltech做的有关细菌诱导酶合成的学术报告。Meselson推测，如果细菌能在重水里培养，然后被转移到一般的水里培养以后一旦加入诱导物，则任何新合成的蛋白质就应该具有正常的密度，与原来老的蛋白质的密度是有差别的，利用密度差异可以将“老”的蛋白质和新合成的蛋白质分开。事实上，如果在一个具有中间密度的溶液中离心，“老”的蛋白质可能沉降下来，而新合成的蛋白质应该悬浮在上面。

不久，他开始将注意力转移到DNA复制的问题。在与Max Delbrück进行了有关DNA双螺旋结构和可能的复制方式的一番热烈的讨论以后，他突然想到相同的方法也许可以用来研究DNA复制。于是，他决定要投入精力去确定DNA复制是否就是按照Watson和Crick预测的半保留的方式进行的。与此决定无关的一件事也许对其最后的成功带来决定性的影响：1954年的夏天，Meselson去马里兰州位于Woods Hole的海洋生物实验室协助Watson进行一些滴定实验，以获得RNA双螺旋结构的证据。巧合的是，来自Rochester大学的Frank Stahl博士也在Woods Hole修生理学课程。一天正当Stahl在树下思考噬菌体遗传性的一个问题的时候，他们相遇了，并从此成为了朋友和学术伙伴。就在Meselson对噬菌体遗传学还似懂非懂的时候，他在微积分上的专长帮助Stahl解决了问题。于是，他们变得更加熟悉了，不久Meselson提出了利用Stahl在研究噬菌体DNA上的特长使用噬菌体DNA来合作研究DNA复制的可能性。他还提出了使用氚来重标记DNA的设想，以此用密度梯度离心来分离重的DNA和轻的DNA。然而，他们很快就意识到使用噬菌体DNA进行实验带来的复杂性问题，因为噬菌体DNA之间存在高频的重组事件，由此引起亲代和子代DNA片段的交换是可以预见的，这势必会影响到结果的分析。幸运的是，Stahl已经打算去Caltech做博士后研究，以方便以后的讨论和合作。既然噬菌体行不通，较为简单的单细胞系统——E.coli也许是一个不错的选择。后来Meselson想知道更多有关DNA合成前体分子性质的知识，在文献调研中，得知胸腺嘧啶的类似物——5-溴尿嘧啶(5-bromouracil，5-BrU)能够代替T参入到正在合成的DNA分子之中。5-BrU相当于T，除了由Br原子代替嘧啶环C5上的甲基以外。Br与甲基具有几乎相同的范德华半径，但由于5-BrU与T的离子化程度不同，Meselson想到也许可以用5-BrU标记DNA，然后利用电泳的方法将它与含有T的DNA分离开来。特别重要的是，他特别想到含有5-BrU的DNA要比含有T的DNA重得多！于是，他考虑使用5-BrU来重标记DNA以验证DNA半保留复制的可能性。因为需要超离心技术的关系，他认识了Caltech的超离心技术奇才Jerry Vinograd，并学会了如何操作当时最先进的Beckman Spinco E型超离心机。在Vinograd悉心指导下，Meselson开始尝试用7 mol/L的CsCl重盐溶液来沉降DNA。使用CsCl的主意来自他认为可以将重标记的DNA与轻DNA分开来的设想——重标记DNA沉降下来，轻DNA悬浮在表面。然而，令他们惊诧的是，在高速离心场下，一种盐密度梯度很快就形成了，而且DNA迁移到与其等密度的区域，形成很窄的条带。于是有关密度梯度离心的概念被Meselson提出来了，相关的论文后来发表在1957年5月份的Proceedings of National Academy Science上。论文中的图和理论计算实际上是他博士论文第一部分的内容。论文中还记录了含有5-BrU的DNA(在含有5-BrU培养基中培养的受T4噬菌体感染E.coli中，得到被5-BrU标记的T4噬菌体DNA)在密度梯度离心中的沉降情况。结果显示，被5-BrU标记的DNA条带所处位置的密度是

1.8g/cm3，而含有T的DNA所在位置的密度是1.7g/cm3。尽管文中没有提到使用这种方法研究DNA复制，但用于研究完整病毒和生物大分子的报道还是非常富有开创性的。

似乎幸运之神正在一步一步地将Meselson和Stahl带到研究DNA复制的里程碑的实验设计思路上去。他们本来想用5-BrU去重标记DNA的，但后来担心5-BrU能诱发DNA突变和因此细胞产生的毒性，以及能否获得标记的均一性的问题，他们决定使用15NH4Cl作为唯一N源的合成培养基去培养E.coli以获得被15N标记的重DNA。他们首先将E.coli放在15NN4Cl培养基中连续培养十几代，得到了几乎都被15N标记的E.coli DNA；然后，随着细菌的指数生长，用10倍过量的14NH4Cl稀释培养基。期间在不同的时段，将DNA从细菌中抽取出来，并使用CsCl密度梯度离心的方法进行分析。

他们的结果是，起初完全被15N标记的DNA具有单一的条带，而在14NH4Cl培养基中培养的第一代细菌中的DNA的密度介于15N-DNA和14N-DNA之间，为杂交带DNA(15N/14N-DNA)。随着杂交带的出现，亲代的条带(15N-DNA)消失了。而在第二代细菌中，得到几乎等量的14N-DNA和杂交带DNA。随着培养代数的增加，杂交带始终存在，而且它的量维持不变，但14N-DNA的量越来越多。由此可以得出结论，DNA复制以半保留的方式进行。为了进一步确认这一点，Meselson和Stahl在密度梯度离心之前用热变性处理CsCl溶液中DNA样品(100℃下30 min)，结果发现，杂交DNA分成了15N-DNA和14N-DNA两条带。不久，他们将数据整理，投给了PNAS，并很快得以发表。