分子教案第三章DNA的生物合成_dna的生物合成教案

分子教案第三章DNA的生物合成由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“dna的生物合成教案”。

第三章

DNA的生物合成教学重点：1．DNA的半保留复制及DNA的半不连续复制2．DNA复制的方式3．DNA复制的调控

教学难点：线形DNA复制末端问题的解决 教学时数：7学时

教学要求：1．掌握并理解DNA复制的特点

2．掌握并理解DNA复制的过程 3．掌握并理解DNA复制的主要方式

4．掌握并理解线性DNA复制末端缩短问题的解决方式 5．了解DNA复制的调控方式

教学方式：讲述、演示与计算机辅助教学 教学内容：

1.DNA复制的特点

证明DNA是遗传物质的两个关键性实验：首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家Avery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验，也证明DNA是遗传物质。这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。

目前认为生物界遗传信息传递的中心法则为

Replication of duplex DNA is a complex endeavor involving a conglomerate of enzyme activities.Different activities are involved in the stages of initiation, elongation, and termination.图1 双螺旋DNA的复制

1.1 DNA的半保留复制(semiconservative replication)Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。

1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记，可以得到15N桪NA。然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察DNA所处的位置。由于15N DNA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心(density gradient centrifugation)时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。实验结果表明：在全部由15N标记的培养基中得到的15N桪NA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N桪NA和14N-DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束后，从管底到管口，CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA－半14N－DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N－DNA)及低密度带(14N－DNA)。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释(图2和16-3)。

图2 DNA的半保留复制第一代分子含有一条亲代的链(用黑色素示)，与另一条新合成的链(用白色表示)配对。在以后的连续复制过程中，原来亲代的两条链仍然保持完整，因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链

图3 DNA的半保留复制－Meslson Stahl实验密度梯度离心后的DNA 位置：左三管为对照；右三管为实验结果

1.2 半不连续性复制（DNA synthesis is semidiscontinuous）

Lagging strand of DNA must grow overall in the 3´-5´ direction and is synthesized discontinuously in the form of short fragments(5´-3´)that are later connected covalently.Leading strand of DNA is synthesized continuously in the 5´-3´ direction.Okazaki fragments are the short stretches of 1000-2000 bases produced during discontinuous replication;they are later joined into a covalently intact strand.Semidiscontinuous replication is mode in which one new strand is synthesized continuously while the other is synthesized discontinuously.On the leading strand DNA synthesis can proceed continuously in the 5′ to 3′ direction as the parental duplex is unwound. On the lagging strand a stretch of single-stranded parental DNA must be exposed, and then a segment is synthesized in the reverse direction(relative to fork movement).A series of these fragments are synthesized, each 5′3′;then they are joined together to create an intact lagging strand.

2．参与DNA复制的有关物质

2.1 DNA polymerases in prokaryoticDNA polymerases are enzymes that synthesize a daughter strand(s)of DNA(under direction from a DNA template).May be involved in repair or replication.DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNA polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写DNA polⅡ,DNA polⅢ)见表1。

这种酶的共同性质是：①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要RNA或DNA做为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNA polⅠ的作用并指出另外二种DNA pol的特殊性：

DNA polymerases typically have nuclease activities as well as the ability to synthesize DNA.A 3′5′ exonuclease activity is typically used to excise bases that have been added to DNA incorrectly.This provides a “proofreading” error-control system, as we see in the next section.2.1.1 DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase I）

The first enzyme to be characterized was DNA polymerase I, which is a single polypeptide of 103 kD.The chain can be cleaved into two regions by proteolytic treatment.The larger cleavage product(68 kD)is called the Klenow fragment.It is used in synthetic reactions in vitro.It contains the polymerase and the 3′5′ exonuclease activities.The C-terminal two-thirds of the protein contains the polymerase active site, while the N-terminal third contains the proofreading exonuclease.The active sites are ~30 Å apart in the protein, indicating that there is spatial separation between adding a base and removing one.The small fragment(35 kD)poees a 5′3′ exonucleolytic activity, which excises small groups of nucleotides, up to ~10 bases at a time.This activity is coordinated with the synthetic/proofreading activity.It provides DNA polymerase I with a unique ability to start replication in vitro at a nick in DNA.(No other DNA polymerase has this ability.)At a point where a phosphodiester bond has been broken in a double-stranded DNA, the enzyme extends the 3′OH end.As the new segment of DNA is synthesized, it displaces the existing homologous strand in the duplex.(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：

(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：

(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：

许多实验证实DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。

2.1.2 DNA聚合酶Ⅱ(DNA polymeraseⅡ)此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。

2.1.3 DNA聚合酶Ⅲ(DNA polymeraseⅢ)这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNA polⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，介链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNA loop的存在。

DNA polymerase III(the replicase)is a large enzyme complex.The replicase activity was originally discovered by a lethal mutation in the dnaE locus, which codes for the 130 kD α subunit that poees the DNA synthetic activity.The 3′5′ exonucleolytic proofreading activity is found in another subunit, ε, coded by dnaQ.The basic role of the ε subunit in controlling the fidelity of replication in vivo is demonstrated by the effect of mutations in dnaQ: the frequency with which mutations occur in the bacterial strain is increased by >103fold.表1 大肠杆菌DNA聚合酶特征

DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合Ⅰ Ⅱ 酶Ⅲ 109KD 400 +

120KD 17-100 + 30低 不详

＞600KD 10-20 + 30,000高 复制

分子量

每个细胞中的分子数 5′→3′聚合活性

37℃转化率核苷酸数／酶

600 分子·分钟 5′→3′外切活性 3′→5′外切活性 切刻平移活性 对dNTP亲和力

+ + + 低 修复

功能

去除引物 填补空缺

2.2真核生物DNA聚合酶(DNA polymerases in prokaryotic)真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性，基本特征见表2。

表2 真核生物DNA聚合酶

亚基数 4

α36-38 核 ＋ －

β160-300 线粒体 ＋ － 复制

γ170 核 ＋ － 复制

δ256 核 ＋ － 复制

ε

分子量（KD)＞250 细胞内定位 核

5′→3′聚合活性 ＋ 3′→5′外切活性 － 功能 复制、引发 修复

真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNA polα，主要负责染色体DNA的复制。DNA polβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子，被认为它与DNA修复有关。DNA polγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNA polδ不但有5′→3′聚合活性，而且还具有3′→5′外切酶活性，据认为真核生物DNA复制是在DNA polα和DNA polδ协同作用下进行的，前导链的合成靠DNA polδ催化。而随从链的合成靠DNA polα和引发酶配合作用完成。2.3 DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质： 2.3.1.解链酶(helicase)DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。2.3.2 单链结合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。2.3.3引发体的形成：

Primer is a short sequence(often of RNA)that is paired with one strand of DNA and provides a free 3´-OH end at which a DNA polymerase starts synthesis of a deoxyribonucleotide chain.(1)引物酶(primase)A primase is required to catalyze the actual priming reaction.This is provided by a special RNA polymerase activity that is the product of the dnaG gene.The enzyme is a single polypeptide of 60 kD(much smaller than RNA polymerase).The primase is an RNA polymerase that is used only under specific circumstances, that is, to synthesize short stretches of RNA that are used as primers for DNA synthesis.DnaG primase aociates transiently with the replication complex, and typically synthesizes an 1112 base primer.Primers start with the sequence pppAG, opposite the sequence 3′GTC5′ in the template.(2)引发体(primosome)高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。2.4 与超螺旋松驰有关的酶：

拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。

表3 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶

类型

Ⅰ型拓扑异构酶 大肠杆菌 真核生物 Ⅱ型拓扑异构酶

切开二股DNA链

大肠杆菌

依赖ATP

真核生物

切开二股DNA链 依赖ATP

松弛正超螺旋； 引入负超螺旋，解环连等 松驰正超螺旋，但不能引入负超螺旋

切开一股DNA链 切开一股DNA链

松驰负超螺旋 松驰正，负超螺旋

作用

对超螺旋的作用

拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。拓扑异构酶Ⅰ除上述作用外，对环状单链DNA还有打结或解结作用，对环状双链DNA的环连或解环连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用(图13)。

拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口，TopoⅡ还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。DNA复制完成后，TopoⅡ在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。DNA复制的过程：



 Initiation involves recognition of an origin by a complex of proteins.Before DNA synthesis begins, the parental strands must be separated and(transiently)stabilized in the single-stranded state.Then synthesis of daughter strands can be initiated at the replication fork.Elongation is undertaken by another complex of proteins.The replisome exists only as a protein complex aociated with the particular structure that DNA takes at the replication fork.It does not exist as an independent unit(for example, analogous to the ribosome.As the replisome moves along DNA, the parental strands unwind and daughter strands are synthesized.At the end of the replicon, joining and/or termination reactions are neceary.Following termination, the duplicate chromosomes must be separated from one another, which requires manipulation of higher-order DNA structure.DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段，第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成，第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。第三阶段为DNA复制的终止阶段。

3.1 DNA复制的起始阶段： 3.1.1 DNA复制的起始点

   The two strands of DNA must suffer their initial separation.This is in effect a melting reaction over a short region.An unwinding point begins to move along the DNA;this marks the generation of the replication fork, which continues to move during elongation.The first nucleotides of the new chain must be synthesized into the primer.This action is required once for the leading strand, but is repeated at the start of each Okazaki fragment on the lagging strand.很多实验都证明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originof replication)常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。

DNA复制起始点有结构上的特殊性，例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的“θ”型复制(由于形状像希腊字母θ)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。3.2 DNA复制的延长阶段

DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程。

这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中作用。

图4 DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成图5 大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图

As the replisome moves along DNA, unwinding the parental strands, it elongates the leading strand.Periodically the primosome activity initiates an Okazaki fragment on the lagging strand.We can propose two types of model for what happens to the DNA replicase when it completes synthesis of an Okazaki fragment.It might diociate from the template, so that a new complex must be aembled to elongate the next Okazaki fragment.Or the same complex may be reutilized.3.3 DNA复制的终止阶段

DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。连接酶(ligase)的作用是催化相邻的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯键相连接。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。连接酶先与ATP作用，以共价键相连生成E桝MP中间体。中间体即与一个DNA片段的5′－磷酸相连接形成E-AMP-5′－DNA。然后再与另一个DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脱下，两个DNA片段以3′、5′磷酸二酯键相连接。随从链的各个DNA片段就是这样连接成一条DNA长链(图14)。

图6 连接酶的催化反应

已有研究证明大肠杆菌染色体DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制的。详细的机制还不完全清楚。

DNA复制完成后，靠拓扑酶将DNA分子引入超螺旋结构。3.4五、真核生物DNA复制的特点：

DNA复制的研究最初是在原核生物中进行的，有些原核生物的DNA复制已经搞得很清楚。真核生物比原核生物复杂得多，但DNA复制的基本过程还是相似的。在这里我们主要讨论一些重要的区别。

图7 端粒酶催化端区TG链的合成1.与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒钟)慢得多，但复制完全部基因组DNA也只要几分钟的时间。

2.SV40病毒DNA主要依靠宿主细胞中的DNA复制体系进行DNA的复制，这是了解真核生物DNA复制的体外模型。在真核生物DNA复制叉处，需要两种不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)。polα和引物酶紧密结合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延长DNA链，这种活性还要复制因子C参与。同时结合在引物模板上的PCNA(增殖细胞核抗原Proliferating cell nuclear antigen)此时释放了polα，然后由polδ结合到生长链3′末端，并与PCNA结合，继续合成前导链。而随从链的合成靠polα紧密与引物酶结合并在复制因子C帮助下，合成岗崎片段(图15)。

图8 真核生物DNA复制叉结构示意图

3.由于真核生物染色体是线性DNA，它的两端叫做端区(telomeres)，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。例如酵母的端区重复序列是5′G(1?)T(3)3′。前面讲到所有生物DNA聚合酶都只能催化DNA从5′→3′的方向合成，因此当复制叉到达线性染色体末端时，前导链可以连续合成到头，而由于随从链是以一种不连续的形式合成岗崎片段，所以不能完成线性染色体末端的复制，如果这个问题不解决，真核生物在细胞分裂时DNA复制将产生5′末端隐缩，使DNA缩短，近十多年的研究表明，真核生物体内都存在一种特殊的反转录酶叫做端粒酶(telomerase)，它是由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′桹H末端延长DNA，再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链(图16)。由此可见端粒酶在保证染色体复制的完整性上有重要意义。

4.DNA复制的方式

4.1

θ-复制replication by θ-structure

4.2

滚环复制replication by rolling cycles structure 13 φX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负

（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。

4.3

D-环复制Replication by displacement loop structure D-环复制（Replication by displacement loop structure)The D loop maintains an opening in mammalian mitochondrial DNA, which has separate origins for the replication of each strand.14

5．DNA复制的调控

5.1 ColEI质粒DNA的复制调控 Rop蛋白、反义RNA

5.2 真核细胞DNA的复制调控 细胞生活周期水平调控（限制点调控）：决定细胞停留在G1期还是进入S期（by cylins,cdc(cell division cycle)gene products）.染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。

复制子水平调控：决定复制的起始与否，并且是高度保守的。