3章.载体总结剖析由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“载体工作总结”。
·作为一个理想的载体，应具备以下条件： 1.具有对受体细胞的可转移性
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.具有多种单一的核酸酶切位点 4.具有合适的选择标记
5.具有较好的安全性，不能任意转移 6.具有较高的外源DNA的载装能力
·克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；
·表达载体（expreion vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； ·穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
·细菌质粒(plasmid)包括三种组成部分：
复制必须区、选择标记基因、限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，MCS).·质粒DNA分子具有三种构型：
超螺旋共价闭环DNA，cccDNA，SC构型
开环DNA，ocDNA，OC构型
线性DNA，cDNA，L构型
·严紧型和松驰型质粒
严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～3个
松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多的可达200～300个
·转移型和非转移型质粒
转移型，结合型（conjugative plasmid）是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移
非转移型质粒(non-conjugative plasmid)则只能在一种寄主中生存（常用于构建克隆载体）
·质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。
·人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。
·实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：
①氯化铯密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染； ②碱裂解法（最常用）：质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间； ③沸水浴法：质粒DNA纯度底、快速、操作简便。
1.pSC101质粒载体
结构：编码一个四环素抗性基因（Tetr）；有多个单一的酶切位点。
特点：严紧型低拷贝质粒，每个细胞仅有1~2个拷贝，所以DNA产量低；插入3个位点，Tetr会失活；具有可插入外源DNA的EcoRⅠ单克隆位点，且不影响其功能。2.ColE1质粒载体
优点：①能产生大肠埃细菌素，还编码使宿住细胞对大肠埃细菌素E1免疫性的基因
②有EcoRⅠ的单一切割位点
③松弛型复制子，几乎是所有人工质粒的组成元件
缺点：以大肠埃细菌素免疫性作为选择标记的体系存在较大的缺陷 3.pBR322质粒载体（应用最广）
组成：①来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr
②来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori
③来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr 特点：①具有较小的分子量（4363bp）
②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号
③利用ColEl的复制子在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增 缺点：pBR322质粒上的EcoRⅠ位点不会发生插入失活，而EcoRⅠ酶又是基因工程中最常
用的一种核酸内切限制酶
4.pUC质粒载体
·在pBR322质粒载体的基础上，加入了一个在其5’端带有多克隆位点的LacZ'基因。组成：①来自于pBR322的Ori（复制起点）
r
②氨苄青霉素的抗性基因(Amp)，但核苷酸序列发生了变化
③ LacZ′基因，编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端
④位于LacZ′基因的靠近5’端的一段MCS区段，但不破坏该基因的功能 ·与pBR322相比，pUC质粒载体优点： ①具有更小的分子量和更高的拷贝数
②适用于组织化学法检测重组体（通过α-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子）③具有多克隆位点区段（MCS），可以定向克隆防止载体自我连接。·β-半乳糖苷酶筛选系统
载体上带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补（α-互补）。故暴露于诱导物IPTG的细菌与含有编码LacZ’的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长，将形成蓝色菌落。5.TA克隆载体
在PCR中，TaqDNA聚合酶在可PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A），而研制出的线性质粒，其5’端各带有一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T）。
·穿梭质粒载体 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
优点：① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；
② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达； ③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。·噬菌体的生活周期
①溶菌周期：烈性噬菌体感染细菌后，立即在菌体内复制DNA和合成外壳蛋白质，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。②溶源周期：温和噬菌体感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中, 这一过程称为溶源化。整合到细菌染色体上的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。-现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。
·溶源周期的主要特征
-λ噬菌体：噬菌体的DNA分子注入细菌细胞，经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭，噬菌体分子的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体，细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。-P1噬菌体：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。
·λ噬菌体
-λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体-λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成-λDNA在噬菌体中是线状双链DNA分子，60多个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长 的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这
就是λ噬菌体可作为基因载体的依据
·λDNA分子的特点 ①长度为48502 bp ②双链线性DNA ③但在两端有cos位点，可以环化
-λcos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为λcos位点
·λDNA复制
早期：一个复制子，双向复制，θ型复制
晚期：滚环复制，多个λDNA分子形成线状多联体
·选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 ①λ噬菌体是一种温和噬菌体 ②能承载比较大的外源DNA片段
③λDNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆
·λ噬菌体的缺点 ①基因组太大 ②酶切点太多。（有5个BamH1位点、5个EcoRⅠ位点、6个BgⅠ位点）③野生型只能接纳一定长度的外源DNA
·λDNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。
·构建λ噬菌体克隆载体的基本策略
-用限制性核酸内切酶切去λDNA上的非必需区-抹去多余的限制性内切酶切割位点
-在λDNA的非必需区内插入选择标记基因（其重组噬菌体DNA大小只能是38kb-52kb）-建立λDNA分子体外包装系统
·λ噬菌体载体的类型
-插入型载体：只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用
于cDNA及小片段DNA的克隆。
只有1~2种限制性核酸内切酶的单一切割位点；大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活-置换型载体：在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆载体，可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。-凯伦噬菌体载体：既有插入型也有替换型。
·cosmid质粒载体：是一类（由人工构建的）含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。用于克隆大片段DNA的载体。
·cosmid 质粒的特点
①具有λ噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌，即不能体内包装）。克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。
②具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，能像质粒一样复制。③方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。④高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。
·M13噬菌体载体（单链DNA噬菌体）①+DNA。（DNA）
②复制型（RF）是双链环状DNA。
③RF-DNA和DNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。④不存在包装限制。
⑤可产生大量的含有外源DNA插入片段的单链分子，便于作探针或测序。
·M13系列载体的优点：
①有MCS，便于克隆不同的酶切片段。②X-gal显色反应，可供直接选择。③无包装限制，克隆能力大。
④可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。
·M13载体的缺点：
①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。
②实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。
·M13的生活周期
·噬菌粒载体
是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。（人工构建）
·噬菌粒具有以下特征
①双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；
②免却了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； ③由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链；
④两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。
·噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。
·PCR产物克隆载体---T载体
-Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。由pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性构成。
-突出特点是MCS的中部已经切开，各有一个5’端突出的T。因PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。
·人工染色体载体
人工染色体实际上是一种“穿梭”克隆载体：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。
·第一受体的克隆子一般采用抗菌素抗性选择标记，而筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。-酵母人工染色体（YAC）：200-500kb，主要用于基因文库构建——克隆大型基因簇（gene cluster）结构&构建动植物基因文库-细菌人工染色体（BAC）：50-300kb，主要用于基因文库构建——易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐
-哺乳动物人工染色体（MAC）：大于1000kb，基因治疗
·基本构件：复制起点、端粒、着丝粒
