HSCT6细胞培养及鉴定实验报告由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“细胞培养实验报告”。
HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告
前言
肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Die间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有：
（1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。
（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
（4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tiue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-
1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。
（5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。
（6）参与肝窦血流调节：HSC伸出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。
一、材料与方法
1.实验材料
1.1实验材料
大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自与中国科学院上海细胞所。
1.2主要仪器
CO2细胞培养箱：上海力康仪器有限公司 Smart Cell HF-90 生物安全柜：上海力康仪器有限公司 HF1200LC 台式高速冷冻离心机：上海力康仪器有限公司 Neofuge 15R 台式低速离心机：上海飞鸽仪器有限公司 TGL-16GB 荧光倒置显微镜：日本尼康公司 Eclipse TS100-F 显微镜：日本尼康公司 E200 病理图文分析系统（工作站）：上海千屏公司 恒温水浴锅：上海精宏仪器厂 DK-80 液氮罐：成都金凤仪器厂 YDS-50-125-20℃低温冰箱：合肥美菱公司 DW-HL388 单子分析天平（0.01mg）：德国梅特勒 AB304-S 手动单道移液器：德国Eppendorf公司 Research plus
1.3主要试剂 名称
PBS磷酸盐缓冲液粉剂 胎牛血清 DMEM培养基 0.25%胰酶
货号/批号
PBS0060, Lot#13061706 16000044，Lot#1183723 C11995599BT，Lot#8113238 25200056，Lot#1268598
厂家
福州迈新生物技术开发有限公司 美国Life technologies公司 美国Life technologies公司 美国Life technologies公司 美国Hyclone公司 美国Santa Cruz公司 青霉素-链霉素双抗（10000U）SC30010，Lot#J130071 小鼠抗a-SMA单克隆抗体
小鼠两步法免疫组化试剂盒 浓缩型DAB试剂盒 FITC标记山羊抗小鼠二抗 油红O染色试剂盒 苏木素染液 油酸 中性树胶
KIT9902，Lot#1301319902 DAB0031，Lot#1307290031 D027
20120702
福州迈新生物技术开发有限公司 福州迈新生物技术开发有限公司 北京中衫金桥有限公司 南京建成生物工程有限公司 福州迈新生物技术开发有限公司 西安化学试剂厂 中国上海标本模型厂
2.实验方法
2.1试剂配制及抗体稀释
10%血清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。
0.2mM的油酸完全培养基：1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培养基中。a-SMA抗体工作液：a-SMA一抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液：FITC标记的山羊抗小鼠二抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。
20%DMSO细胞冻存液：2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培养基中。
油红O染液：油红O储存液与双蒸水以3:2的比例混合，并用滤纸进行过滤，使用前2h内配制。
2.2 HSC-T6细胞培养基本操作方法
细胞传代：观察培养瓶（25cm）中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代，操作步骤如下。开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶（25cm）、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800r/min离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养，6h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%～70%贴壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5ml的22含0.2mM油酸的完全培养基，继续培养。
细胞冻存：消化、离心、重悬步骤同细胞传代，取1ml的细胞重悬液，加入1ml的20%DMSO的细胞冻存液颠倒混匀，并移至2ml的冻存管中，冻存管中细胞经4℃（20min）、-20℃（20min）的程序降温后，转移至液氮中冻存。
细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37℃水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻，倒置显微镜下观察细胞密度并接种到培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。
2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化染色
细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA免疫组化实验，步骤如下：
2.3.1 细胞固定：培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和甲醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.3.2细胞通透化：
培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.3.3封闭
用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.3.4一抗孵育
培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL，4℃孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.3.5二抗孵育
培养皿中滴加Elivision试剂盒中的增强剂1滴（大约50μL），并于室温孵育20min，PBS漂洗3次，每次3min，然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴（大约50μL），37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次3min。2.3.6 DAB显色
培养皿中滴加新鲜配制的DAB溶液50μL，室温孵育10min，显微镜下观察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时，立刻将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。2.3.7苏木素复染
苏木素复染3min，自来水冲洗使培养皿中的细胞核返蓝。2.3.8封片
培养皿中滴加甘油，并以盖玻片封片。2.3.9观察拍片
在正置光学显微镜下观察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激动蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。
2.4 HSC-T6细胞a-SMA细胞免疫荧光
细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA细胞免疫荧光实验，步骤如下：
2.4.1 细胞固定：培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和异丙醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.2细胞通透化：
培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.3封闭
用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.4.4一抗孵育
培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL，4℃孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.4.5二抗孵育
培养皿中滴加50μL稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min。2.4.6观察拍片
设置荧光倒置显微镜激发波长为488nm，观察细胞alpha-平滑肌肌动蛋白荧光显色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。
2.5 HSC-T6细胞油红O染色
细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，并以含0.2mM油酸的完全培养基进行干预，使
细胞富集脂肪滴，细胞待细胞达到50%贴壁融合时，进行油红O染色实验，步骤如下： 2.5.1 细胞固定：培养皿中加入4%多聚甲醛溶液，室温固定30min，弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.2油红O染色：
培养皿中加入1ml新鲜配制的油红O染液，室温放置10min后弃去染液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.3苏木素复染
培养皿中加入1ml苏木素染液室温染色30s，弃去苏木素染液，以双蒸水漂洗3遍，每次5min，加入1ml的自来水反蓝。2.5.4封片
培养皿中滴加一滴甘油并以盖玻片封片。2.5.5观察拍片
正置光学显微镜下观察肝星状细胞胞浆中红色脂肪滴染色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。
2.6 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴荧光观察
设置荧光倒置显微镜激发波长为328nm，观察培养的HSC-T6细胞胞浆中Vitamin A脂滴荧光。
二、结果与分析
1.HSC-T6细胞培养传代的形态学特征基本情况
HSC-T6细胞株培养5-8代时能观察到细胞较大，呈多边形、多核，且胞浆富含脂滴及Vitamin A形态（见图1），8代以后继续培养HSC-T6细胞表现为肌成纤维样细胞的形态学特征，即HSC-T6贴壁后即开始伸展，胞体增大呈不规则的多边形，并伸出许多伪足与其他HSC-T6细胞相连形成片状（见图2）。HSC-T6细胞大量增殖，细胞密度变大后，细胞形态变小，略呈梭形的多边形，且有伪足与相邻细胞相连，在培养表面均匀的分布(见图3)。
A
B
C
D
图1 5-8代HSC-T6细胞形态特征
A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×
（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）
A
B
C
D
图2 8代后HSC-T6细胞形态特征
A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×
（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）
A
B
C
D
图3 HSC-T6细胞密度加大时形态特征
A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×
2.HSC-T6细胞鉴定
2.1 HSC-T6细胞脂肪滴油红O染色
含0.2mM的油酸的完全培养基使HSC-T6细胞富集脂滴，并用油红O染液染色，光学正置显微镜下观察胞核呈蓝色，胞浆中有点状红色，为脂滴着色（见图4）。
图4 HSC-T6细胞脂滴的油红O染色 400×
2.2 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴紫外激发的自发荧光
HSC-T6细胞中的脂滴在328nm紫外波长的激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光（见图5）。
图5 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴328nm紫外激发荧光 200× A、B：暗场Vitamin A脂滴荧光； C、D叠加场Vitamin A脂滴荧光
2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化
HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，细胞爬片显示HSC-T6细胞胞浆均可见棕黄色颗粒状沉淀，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色为阳性。
A B C D 图6 HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色（A：100×； B、C、D：400×）
2.4 HSC-T6细胞a-SMA免疫荧光
HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，a-SMA免疫荧光显示HSC-T6细胞胞浆均可见FITC的激发的绿色荧光，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫荧光为阳性。
A1 A2 B1 B2 C1 C2
D1
图6 HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色
D2（A1、B1、C1：荧光倒置显微镜下明场观察 200×；A2、B2、C2：荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察200×；D1荧光倒置显微镜下明场观察 400×；C2：荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察400×）
