Qiagen80004 抽提RNA、蛋白和DNA由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“蛋白质和dna提取”。
实验目的:白三烯受体mRNA的表达
实验方法：（半）定量聚合酶联反应
实验步骤：
一、抽提RNA
实验器具和材料
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、2ml、200ul、10ul（5）电动匀浆器（6）50ml离心管
（7）饭盒
（8）冰盒
碎冰
（9）酒精纱布，供清洁桌面和试管架等。
2, 实验器具的处理与准备
（1）金属制品：（镊子等）提前确定组织的重量，如果组织需要分割，还需要一个刀片。先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：直接购买配置好的。DEPC剧毒，购买那些已经高温高压处理去除DEPC的水。
（2）配70％乙醇：用DEPC水和无水乙醇按照3：7的比例配置。实际上，用超纯水配置也可以，因为70％乙醇用来提取蛋白，不涉及RNA降解的问题。（3）无水乙醇（4）
β-ME（5）
DTT
（6）Buffer RLT、buffer ALO、Buffer RPE、buffer AW1、buffer AW2、Buffer EB
准备工作：
1.在每 1 ml Buffer RLT 中加入10 ul β-ME(加入β-ME的Buffer RLT可在室温下放置1月)。根据实验需要吸取Buffer RLT，不要把 β-ME加到瓶子里。2.每1ml buffer ALO中加入8mg DTT。根据实验需要吸取Buffer ALO。
3.Buffer RPE、buffer AW1、buffer AW2中加入一定体积的无水乙醇。瓶盖上打钩说明已加入无水乙醇，如果没有打钩，需要加入无水乙醇。
4.buffer RLT可能会有沉淀，必要时可适当加热使其溶解，在室温中保存。5.预热Buffer EB至70℃（此步骤适用于抽提DNA）。
实验步骤： 样本研磨和匀浆。
1.取组织：30mg、在干净的表面、速度要快。（根据组织重量决定buffer RLT和其他试剂的用量）
2.研磨组织，在600ul buffer RLT中匀浆化：电动匀浆器。冰上操作。
3.最大速度离心溶解产物3分钟。用吸量管将上层清液转入放置着Allprep DNA spin column的2ml收集管（紫色柱子）中。轻轻盖上盖子，8000×g(or 10000rpm)离心30s。注意：有时，在3分钟离心后还存在着少量的未溶解的物质，要使这些不可见；确定离心后没有液体残留在column membrane，必要时可重复离心直到液体都通过膜。
4.将Allprep DNA spin column 放在一个新的2ml收集管中，并且在室温中保存或者在4℃为了之后的DNA提纯。在后面的RNA提纯使用流出液。
注意：不要在室温或者4℃情况下保存Allprep DNA spin column太长时间。不要冰冻柱子。
RNA提纯
5.在刚才第4步的流出液中加入430ul无水乙醇：250ul（buffer RLT 350ul）或者430ul（buffer RLT 600ul）。用吸量管充分混合。勿离心，马上进入第6步。
注意：若匀浆的液体有所丢失，相应地减少无水乙醇的量。这步可能会产生沉淀物，但是并不影响之后的过程。
6.将样本（约700ul，包括可能形成的沉淀）加入到RNeasy spin column中（粉色柱子，放在一个2ml的收集管中），轻轻盖上管盖，8000×g(or 10000rpm)离心15s。为了之后的蛋白提纯，将流出液转移到一个2ml 的管子中。
注意：该收集管可在第7步中再使用。如果样本量超过700ul，再离心。
7.将700ul buffer RW1 加入RNeasy spin column（粉色柱子）中。轻轻盖上管盖，8000×g（or 10000rpm）离心15s。弃掉流出液。收集管继续使用。
注意：在离心后，小心转移RNeasy spin column，以避免column接触到流出液。确定将收集管中是完全空的。
8.将500ul buffer RPE 加入RNeasy spin column中。轻轻盖上盖子，8000×g（or 10000rpm）离心15s，弃掉流出液，收集管再用。
9.将500ul buffer RPE 加入RNeasy spin column中。轻轻盖上试管8000×g（or 10000rpm）离心2min。（此次长时间的离心可以使柱子的膜干燥，以保证在RNA洗脱过程中没有乙醇残留。）
注意：在离心后，小心转移RNeasy spin column，以避免柱子接触到流出液。
10.可选：将RNeasy spin column转到一个新的2ml收集管中，并且弃掉旧的含有流出液的收集管。最大速度离心1分钟。
11.将RNeasy spin column转到一个新的1.5ml收集管中。直接将30-50ul的Rnase-free water加入柱子的膜中。轻轻盖上盖子，8000×g（or 10000rpm）离心1min以洗脱RNA。
12.如果预期的RNA产生大于30ug，可以另外再用30-50ul的Rnase-free water重复上一步的操作，或者如果需要高浓度RNA就直接使用上一步的洗出液。上一步的收集管继续使用。提取的RNA：-80℃冻存，但最好直接逆转录成DNA。
蛋白沉淀
13.在第6步的流出液中加入1倍体积（通常600ul or 1000ul）的buffer APP。用力混匀并在室温中静置10分钟以使蛋白沉淀。
14.最大速度离心10分钟，用枪小心吸掉上层清液。
15.在蛋白颗粒中加入500ul 70%的乙醇，最大速度离心1分钟，用枪小心移除上层清液。
16.在室温下吹干蛋白颗粒，大约5至10分钟。
17.加入100ul buffer ALO，并用力混匀以使蛋白颗粒溶解。
18.在95℃下静置5分钟以使蛋白完全溶解及变性。随后冷却样本。
19.最大速度离心1分钟。上层-20℃保存，western用；沉淀-20℃保存，备用。
DNA提纯
20.往之前第4步中的Allprep DNA spin column加入500ul buffer AW1，轻轻盖上管盖，8000×g(or 10000rpm)离心15s。弃掉流出液。Spin column继续使用。
21.往Allprep DNA spin column加入500ul buffer AW2，轻轻盖上管盖，最大速度离心2min。
注意：在离心后，小心从收集管中移出Allprep DNA spin column。如果柱子中含有流出液，倒空收集管并再以最大速度离心1分钟。
22.将Allprep DNA spin column放置到一个新的1.5ml收集管中。直接将100ul buffer EB 加入spin column membrane并关上盖子。在室温中静置2分钟，然后 8000×g(or 10000rpm)离心1min以洗脱DNA。
23.重复上一步。
注意：使用新的1.5ml收集管来收集第二次的DNA洗出液。重复使用上一步的收集管使两次洗出液混合。
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit可从同一细胞或组织样本中同时纯化基因组DNA、总RNA和总蛋白质，使样本制备流程流畅高效（参见流程图“AllPrep DNA/RNA/Protein procedure”）。使用此试剂盒无需在纯化前将样本分为三份，因此DNA、RNA和蛋白质的回收水平达到最高。此外，纯化过程中无需使用酚和丙酮等有机溶剂。细胞或组织样本首先在Buffer RLT中裂解，使得DNA酶、RNA酶和蛋白酶立刻失活，确保可分离得到完整的DNA、RNA和蛋白质。用AllPrep DNA离心柱过滤裂解液。使用该离心柱和高盐缓冲液可高效的选择性结合基因组DNA。洗脱之后即可得到即用型DNA。
在AllPrep DNA离心柱的流出液中加入乙醇，形成适合RNA结合的条件。用RNeasy离心柱过滤样本，总RNA与膜结合，污染物被去除。然后用不含RNA酶的纯水进行洗脱，得到高品质RNA。
Buffer APP是新型的水溶性蛋白沉淀溶液。将其加入RNeasy离心柱的流出液中，然后离心得到蛋白质沉淀。用适合的溶液溶解完整的总蛋白质，即可直接用于下游应用。此试剂盒包括Buffer ALO，该缓冲液用于溶解蛋白沉淀，不影响SDS-PAGE操作。
应用
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit标准化了系统生物学研究中的样本制备过程。DNA、RNA和蛋白质为同一来源，减少了从不同样本中制备这些分析物时引起的内在差异。
