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现代生物技术在植物检疫中的作用
摘要：本文阐述了免疫学技术中的酶联免疫法、免疫荧光技术、斑点免疫法、免疫电镜技术、免疫染色标记技术及其他抗体介导的检测方法、核酸技术中的核酸探针、RFLP技术、PCR技术等的在植物检疫中的应用原理及优缺点。关键词：免疫学技术；核酸技术；植物检疫
随着我国动植物产品进出口贸易的日益增多，传统的检测手段已不能满足植物检疫需要，检疫手段的优化迫在眉睫，近年来在免疫学、分子生物学等领域取得了巨大的进步，为全面优化检疫手段，加快检测速度打下了坚实基础。1 免疫学技术
1.1 酶联免疫法
自酶联免疫吸附技术问世以来，已日益广泛应用于植物病毒、真菌、MID等的检测之中，如病毒方面，对种子中的大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、等病毒的诊断和检测；真菌方面，疫霉、腐霉、黑盘菌、等真菌的ELISA试剂盒已被商业化生产，并已广泛应用。利用上述ELISA试剂盒检测大豆根茎组织、土壤悬浮液中的大豆疫霉菌；土壤中大豆疫霉的游动孢子、卵孢子和菌丝；病组织中隐地疫霉；灌溉水中的疫霉游动孢子，效果都很好[1]。
1.2 免疫荧光技术
免疫荧光技术是另一种以抗体为基础的在植物病害检疫中具有重要应用价值的检测手段，现已成功应用于植物组织、种子及土壤中细菌及真菌的检测。利用免疫光技术成功的检测出菜豆萎蔫病菌，并且检测的灵敏度达到4.5×lO4cuf／mL，有效地解决了假阳性反应问题。此外，免疫荧光技术在检测土壤根组织的辣阑疫霉菌丝、土壤中樟疫霉游动孢子、瓜果疫霉游动孢子、叶组织中灰葡萄孢；病土、根组织中芸苔根肿菌休眠孢子；根组织中菌丝的厚垣孢子、组织切片中菌丝均取得了ELISA无法达到的效果。免疫荧光技术具有间接和直接免疫荧光法，其中间接免疫荧光法在实践中用途较广，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微进行检测，如利用免疫光技术可在显微镜下检测出结合有荧光色素抗体的细菌阳性细胞，免疫荧光技术检测的灵敏度一般约为lO3～lO5 cfu／mL，不仅对每个荧光细胞可以记数，而且可以观察有关细胞的形
态特征。虽然免疫荧光技术灵敏度高，但在实际使用中存在一定的缺陷，如需要昂贵的仪器，操作费时，并且有时受植物和土壤的自身荧光干扰，特别是在抗原量低时，自发荧光强于特异性荧光，致使观察困难，干扰了这项技术的广泛应用。
1.3 斑点免疫法
斑点免疫法技术是近年发展起来的血清学技术，它是通过酶标记抗体与吸收附于硝酸纤维素膜(简称NC)、尼龙膜或其他支持物上的抗原发生特异性结合，经加底物溶液后在NC膜上形成有色斑点的免疫学方法。目前已被应用于植物病毒、MID的检测之中。同ELISA相似，斑点免疫法也可以分为多种，较常用的有直接法、间接法、双抗体夹心法。斑点免疫法操作简便、快速、能够长期保存，在灵敏度方面也高于DASM-ELISA[2]。斑点免疫技术是一项十分有用的血清学技术，它的一个重要用途是组织免疫印迹，通常可以将组织材料(如切割开的种子)直接与硝酸纤维素膜接触，抗原从组织中释放，并结合于膜上,通过直接法检验或使用辣根过氧化物酶(或碱性磷酸酶)标记间接检测结合于膜上的抗原。由于斑点免疫检测技术具有与电镜观察法同样高的灵敏度，且操作容易、简便，试验本身血清用量少,且可重复利用，一次性检测的样品量大，因此是一种适合检疫需要的快速诊断检测方法。
1.4 免疫电镜技术
免疫电镜技术应用于植物病毒检测始于20世纪60年代，70年代以来发展较快，由于免疫电镜技术快速、准确、省工、省抗体和抗原材料，且制好的铜网以及抗血清的包被铜网均好保存一段时间，并可邮寄，因此该技术已广泛应用于植物病原真菌、病毒、MLO以及类病毒的检测中。免疫电镜技术具有与ELISA相同的灵敏度但比E1ISA更为直观、准确、快速，对于某些难于鉴定的木本植物病毒也可检测。
免疫电镜技术可直接检测感染病毒的组织抽提液(包括显症、未显症、脱毒苗)，除了病毒定性外，免疫电镜技术还可以用在植物粗汁液中病毒粒体的定量分析。此外，免疫电镜技术克服了以往检测MID只能用超薄切片进行电镜观察的缺点，现已能用诱捕法诱捕MLO。免疫电镜技术还可以检测dsRNA，已成功用诱捕法诱捕到被TMV感染的植物中复制型的dsRNA，并利用dsRNA抗学清诱捕到真菌病。可以看出，由于免疫电镜技术的诸多优点，因此该技术成为目前较为理想的检测
手段之一[3]。
1.5 免疫染色标记技术
Iin和Langenberg等在20世纪80年代首次将胶体金染色技术成功应用到植物病毒的检测。胶体金染色技术是利用金离子还原后的胶体金与抗体(或A-蛋白)结合形成稳定的抗体(或蛋白)-胶体金复合物，通过抗原的特异性结合，金颗粒附于同源病毒粒体的周围，从而得到检测病毒的一种免疫技术。以后，又对胶体金技术进行了改进，产生了金／银免疫法染色法、斑点免疫金染色以及斑点金／银染色法，并在植物病毒、细菌等的检测上得到了广泛的应用。免疫胶体金技术不仅可检测和鉴定出植物病毒，还可以确定植物病毒在感染细胞中的复制部位以及病毒基因产物在细胞中的合成部分，现已成功地用胶体金标记了马铃薯黄矮病毒的结构蛋白以及一些复制酸组分、转移蛋白等非结构蛋白。免疫金染色技术和免疫金／银染色技术具有省时、灵敏、稳定、价廉的优点。缺点是胶体金标记不易与小分子物质形成稳定复合物，并对盐类极其敏感，此外，胶体金标记的组织切片，微细结构对比度不是太好，细胞膜也不能清晰可辨，对于球型病毒，如果分散在细胞中就不易辨认。不过，随着单克隆抗体、CDNA探针与免疫胶体金等染色技术的结合使用，免疫染色标记技术的灵敏度将会进一步提高，相信不远的将来它将成为检测方面的一种非常有用的工具。
1.6 其他抗体介导的检测方法
EILSA和其他免疫学方法的检测基础均是抗体成分，并且由于抗体的专化性和对特殊抗原的亲和性，使得这些方法具有可定量测定的特性。另外，多克隆抗血清在一定程度上可满足检测的需要。多克隆抗体的制备简单便宜，纯化和酶结合的步骤也较为简便，在某些情况下对克隆抗血清的专一性要求并不严格，目的是大范围检测到目标病原菌，美国、巴西等多个国家已成功利用多克隆抗体检测柑桔衰退病病毒。然而，对于较为复杂的病原菌如细菌和真菌，多克隆抗体常常不能专一性地检测出目标病原，且多克隆抗体存在寄主抗原交互反应问题。单克隆抗体可克服这些缺点，是免疫学方法上的一项巨大的技术革新。单克隆抗体广泛应用于病毒、细菌、线虫等的鉴定和检测。单克隆抗体具有多克隆抗体难以媲美的优点，但由于其制备方法复杂、周期长、工作量大、价格昂贵、具体环节受影响的因素较多，在一定程度上限制了单克隆抗体的应用。核酸技术
20世纪80年代末至90年代初出现了利用核酸杂交技术检测植物病原的报道，并比较了核酸杂交技术与以抗体为基础的免疫学方法的优缺点，从中看出，核酸杂交技术在灵敏度、检测率及专一性等方面均比免疫学方法有了很大的提高，特别是PCR技术可以直接对病原物序列进行检测，从而大大提高了检测时的准确性。
2．1 核酸探针
核酸探针是利用经过标记(同位素或非同位素)并用于检测出互补核酸序列的一段寡聚核苷酸。核酸探针技术已应用于植物病害诊断和植物病原物的检测之中。典型的核酸杂交技术是将少量核酸打点在硝酸纤维膜或尼龙膜上，再浸入含特异性探针的杂交液中，通过放射显影或酶标颜色反应检测。杂交检测方法有多种，其中印迹杂交法非常方便，其灵敏度较世界ELISA方法灵敏2-3个反应级，而且杂交后的产物可干燥保存，这使得该杂交探针易于商业化并能够广泛应用在植物病毒、类病毒以及类菌原体等的检测。核酸杂交技术虽然在检测病原菌方面表现出它的优势，但由于其烦琐操作以及缺少灵敏的探针标记而限制了其普及应用。同位素标记灵敏度高，但同位素标记费用高、实验条件严格，且有放射性危害，标记好的探针在几周内其放射活性就衰退到不能使用，因而不宜大规模推广。非放射性的生物素克服了这些缺点，因而非放射生物素-亲和性系统被应用于各种病害检测，而在类病毒的检测上光生物素标记探针具有与同位素标记一样的灵敏度。目前应用于柑桔裂皮病检测的3种生物素：光生物素、生物素肼标记中，DIG标记的灵敏度最高，应用最广，由于非同位素标记具有同位素标记无可比拟的优越性；灵敏度高、费用少、对人体无害、保存时间长且稳定，非常适合口岸检疫技术的需要，它必将成为一种有力的检测工具。
2.2 RFLP技术
RFLP是一项比较复杂且耗时长的DNA检测技术。但它又是研究植物病原种群结构和遗传变异很好的工具。它先从生物组织中纯化DNA，用限制性内切酶切割后，利用凝胶电泳分离切割后的片段，接着进物染色，最后用标记的探针进行杂交。该技术能够快速鉴定到病原物种、变种、专化型和生理小种，RFLP分析是一种非常有效的分子生物学技术，具有敏感性高、所需样品少，快速简便等优点，随着分子生物学的发展，相信RFLP技术在病原物的鉴定和检测方面将得到更广泛的应用，尤其在检疫方面会越来越显示其巨大的优越性。
2.3 PCR技术
PCR技术是一种DNA体外扩增技术。在PCR反应中，将含有所需扩增的靶DNA双链经高温变性变成单链，在接着的退火中加入的寡聚合核苷酸引物与DNA模板结合，并在经这十几个循环后，靶DNA的含量将特异性扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。由于这一技术具快速、简便、灵敏度高和特异性强的优点，因此PCR技术在植物病害诊断和病原物检测方面具有巨大的应用潜力，现已在植物细菌、病毒、类病毒、真菌、线虫等检测中发挥了重要的作用。PCR技术应用起来比较复杂，且需要相当昂贵的仪器设备和专业化的技术支持，因此目前只限于实验室中使用，难以推广普及，随着研究的不断深人及分子生物学的快速发展，PCR技术将在植物病害的检测方面发挥更大的作用。
实时荧光定量PCR(Real—time fluorescentquantitative PCR，FQ—PCR)技术是20世纪9O年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。最早是由Higuchi等，于1992年提出来的。1996年由美国Applied Biosystems公司推出。与普通PCR相比，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。但是实时荧光PCR技术也有其局限性，会受到非靶序列DNA的干扰，如何排除背景的影响，使实时荧光定量PCR具有普遍性是人们面临的又一个挑战
[4]。
总之，免疫技术和核酸技术以其灵敏、准确、快速的特点越来越受到人们的重视，为植物检疫工作的开展提供了强有力的技术支撑，如果能与其他传统方法相结合，将会推动口岸检疫工作更好地发展。
参考文献
[1]朱延书,康宁.生物技术在植物检疫检测中的应用[J].江苏林业科技.2003.06.[2]陶玲珠,杨洁磊．斑点免疫结合法对进口马铃薯脱毒组培苗的病毒检测[J].植物检疫,1992,6(2):ll8．
[3]胡伟贞,由雪娟.免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用和进展[J].植物检
疫.1990,4(5):356-359.[4]黄海泉.实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展[J].湖北农业科学.2012,1:5-8.
