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纤维蛋白-磷灰石复合材料的仿生制备
摘 要：双向扩散的Ca和PO4的溶液加入到纤维蛋白凝胶中，在不同pH条件下和氟离子的浓度进行仿生矿化反应生成有机/无机模仿生物矿化复合材料。在这个系统中产生的矿物比在溶液矿化系统中产生的矿物具有较高的结晶度。在纤维蛋白凝胶中由于pH条件不同生成的矿物也不同，如下所示：当不受酸碱约束下获得的矿物是DCPD；当PH是7.4时，获得的矿物是DCPD和OCP的混合物；当PH是9.0时，获得的矿物是OPD和HAP的混合物。当氟离子浓度在2-500ppm变化时，在PH是7.4时，凝胶系统中产生的矿物也在改变，从OCP/HAP复合材料转变为HAP/ FAP复合材料。此外，所获得的矿物的结晶度随随氟离子在增加而增加，同时晶度和溶解度呈负相关关系。总之，我们建立了新的有机/无机复合材料合成方法，这种材料是由纤维蛋白和钙磷酸盐组成的，同时表明合成的矿物特征可由制备条件控制。
关键词：仿生材料，生物矿化，钙磷酸盐，水凝胶，氟离子
引 言
经过深入的研究表明，在骨组织工程学领域，有机或者无机的复合材料与骨组织具有良好的生物相容性，能够提高它们的机械性能和促进骨组织再生。大多数有机或无机复合材料都是几种简单的有机或无机材料经过复合制备的，但是模拟生物硬组织的复合材料的制备方法并没有被很好的介绍。
生物硬组织，例如骨骼和牙齿的釉质，是在细胞外基质（ECM）中钙磷酸盐环境中经过成核，晶体生长而形成的。例如，骨钙蛋白或者别的非胶原蛋白，是通过典型的I胶原质化学连接的，它们和羟基磷灰石（HAP）具有良好的生物相容性。在釉质的形成过程中，自我组成的纳米釉源蛋白调节磷灰石的晶体形态，因此，ECM扮演中重要的角色，它不仅提供场所供矿物结晶沉淀而且对于生物硬组织的生长能够控制生物矿物的成核，结晶形态和结晶方向。在多样的水凝胶方向，一些研究已经开始使用钙化系统和尝试了解基质蛋白在生物矿化过程中的作用。例如Boskey et al曾建立了动物胶和琼脂糖胶 的扩散系统，证明非胶原蛋白在HAP的制备过程中起到促进还是抑制作用。Hunter et al.曾使用丙烯酰胺凝胶 研究它在体外的矿化过程。因此在有机基质中矿物的形成被认为是模拟生物硬组织生长矿化方法的一种。这些有机或无机复合材料经过仿生过程制备可能对于骨组织工程学的研究有非常大的作用。但是在以上提到的凝胶系统中无机相的制备大多数是由结晶度低的磷灰石组成的。在骨组织工程中，控制好无机相在复合材料中的性能是非常必要的，这是因为材料在医学治疗应用上需要一些特别的性能如可吸收性。为了控制好这些无机材料的性能，我们尝试在不同条件下制备复合材料。
在HAP中加入氟化物能够提高材料的稳定性，这是通过在晶格中用氟离子取代氢氧离子。氟离子在血清中浓度为0–0.13 ppm，但是在骨组织中浓度提高到800ppm，釉质中达到350-1000ppm。因此，对于生物硬组织的生长过程中，氟化物在调节矿物性能上显然起到关键作用。除此之外，在矿化过程中，PH也是一个重要的因素。因此在矿化过程中，控制复合材料中无机性能这些因素都是非常重要的参数。
在组织工程学上使用纤维蛋白凝胶是非常有益的，这是因为它具有生物相容性和生物降解性。更重要的是纤维蛋白能够从个人的周围血提取，因此在这次研究中我们选择纤维蛋白作为有机成分。在这次的研究中，在不同的条件下，我们使用纤维蛋白凝胶进行体外矿化和研究在凝胶中生成的矿物的性能是为了获得无机成分在有机或无机复合材料中多样性的特点。
材料和方法
体外纤维蛋白凝胶的矿化过程
凝胶扩散系统的制备过程如下：纤维蛋白（4mg/mL)和凝血酶溶液（2.5单位/mL）以1:1比例混合均匀。取240μL溶液倒入聚乙烯试管（直径=8mm）在37。C保温箱中放置30分钟以便于凝胶。100 mM 的(CH3COO)2Ca.2H2O和60mM的 NH4H2PO4溶液以相反的方向倒入以制好的凝胶促进矿化作用，如图一所示。整个系统在保温箱内维持37。C放置3天。Ca溶液和PO4溶液初始PH分别为7.6和4.5.为了研究溶液PH在矿化过程中的影响，通过添加HCl和NaOH分别调节两个溶液的PH值到7.4和9.0.在每一个矿化情况下测定纤维蛋白凝胶的PH了解矿化前后PH的变化。研究氟化物在矿化作用中的影响，2-2000ppm HF被加入
。到PO4溶液中。为了控制整个溶液系统的矿化作用，在37C下25mL的Ca溶液直接倒入25mL的PO4mL。
矿化产品的评价
矿化作用后，将凝胶系统在室温下风干24h，然后将获得的产品用粉末X射线衍射分析法鉴定产品。（002）高度的一半值被认为是制的的矿物的结晶度指数。
矿物的沉淀现象和晶体的形态用扫描电子显微镜观察。对于扫描电子显微镜观察时，在以矿化的纤维蛋白凝胶中加入4%多聚甲醛，然后用磷酸盐缓冲溶液洗涤六次后在加入1%的OsO4再用磷酸盐缓冲溶液洗涤六次，最后用浓度达到100%de 乙醇进行脱水。凝胶用CO2在临界温度干燥45分钟
图1（A）示意图凝胶扩散系统：Ca2+和PO34-在凝胶系统中以相反的方向扩散到纤维蛋白胶，以促进凝胶矿化。（B）纤维蛋白凝胶的尺寸：8mm×3.4mm（直径×厚度）：（a）纤维蛋白凝胶（b）矿化4小时（c）矿化3天
溶解度的测定
为了评价制的的样品的生物降解性，我们进行了体外溶解度测定实验。样品浸入到PH为4.8的浓度为0.1moL/L的10mL醋酸盐缓冲溶液中，在37。C下保温5天，剩下的样品被完全溶解在10mL的HCl溶液中，每个溶液中Ca离子的浓度使用先前描述的一种方法原子吸收的分光光度计测定。在凝胶中矿物的溶解度被定义为被洗提的 Ca 离子的含量与组成的凝胶中的初次的 Ca 含量的比值。
结果
体外纤维蛋白凝胶的矿化过程
矿化作用后，一个白色矿物沉淀（能带）在纤维蛋白凝胶中被观察了10 分钟，然而在矿化凝胶系统溶液中，当Ca溶液被滴加到PO4溶液中立即就观察到白色沉淀。最初，在纤维素凝胶的矿物沉淀被观察了在Ca 溶液被倒的区域（C 边）, 和能带区域然后扩大为这PO4 溶液被倒的区域（P 边）。最后，4小时后凝胶体全变白了。如图1（B）
在矿化前凝胶的PH为6.61，在表一的条件下凝胶系统PH值在24小时后将会增加。
表一
矿化24小时后纤维凝胶系统的PH值
条件 PH值 矿化之前纤维凝胶 6.61 +_0.12 不受酸碱约束 5.14 + 0.15 PH为 7.4 6.09 + 0.20 PH为 9.0 6.48 +0.24
矿化产品的评价
利用XRD分析可以了解在不同PH条件下矿物性能。在矿化系统溶液在不受约束的酸碱质条件之下获得矿产品是二水磷酸氢钙（DCPD），在PH为7.4时获得的是 磷酸八钙（OCP）和羟基磷灰石（HAP）的混合物，在PH为9.0时，获得的也是OCP和HAP的混合物。在凝胶系统中，在不受约束的酸碱质条件之下获得矿产品是二水磷酸氢钙（DCPD），在PH为7.4时获得的是 磷酸八钙（OCP）和二水磷酸氢钙（DCPD）的混合物，在PH为9.0时，获得的也是OCP和HAP的混合物。如图2.（A）观察XRD的轮廓可知，在凝胶扩散系统中矿物的结晶产物明显高于在矿物溶液系统中产生的。
为了了解目前的氟离子对凝胶系统中对矿物产生的影响，因此，在不同的PH条件下分别向磷酸盐溶液中加入200ppm的氢氟酸，然后使用XRD方法研究在纤维蛋白凝胶系统中矿物的生成量。结果显示，在任何pH值下纤维蛋白凝胶系统中矿物的生成都为羟基磷灰石/氟磷灰石（FAP）的。此外，在每个样本中样品的结晶度没有明显差异，如图2（B)。为了进一步研究成矿条件，我们选择pH值7.4，这是因为这种条件与生物的环境条件相似。
在凝胶系统中，为了获得矿物成分的不同程度的结晶和溶解度，我们向凝胶成矿系统中添加了不同浓度的氟离子（2—2000ppm)。XRD分析表明，在不加氟离子的情况下，所产生的矿物是DCPD和OCP的混合物，在氟离子浓度达到20 ppm时，产物是OCP和HAP的混合物，并在氟离子浓度达到500 ppm时，产物是典型的HAP/ FAP的混合物。最后，X射线衍射图谱表明，在氟离子浓度超过500 ppm时，产生的矿物是HAP/ FAP的复合材料和氟化钙（CaF2）的混合物，如图3（A）。为了估计氟离子对矿物结晶的影响，结晶指数被认定为在（002）峰逆宽度的半值。当氟离子浓度达到100ppm时，结晶度明显提高并且氟离子浓度高于100ppm时，其饱和（图4）。当氟离子浓度从0到500ppm变化时，（300）反射峰位置转移到更高的角度，表明在矿物中FAP的成分也随着氟离子浓度增加而增加图3（B）。
为了了解在纤维凝胶系统中晶体的生长过程，在20 ppm的氟离子条件下获得了不同的时间点的以矿化的凝胶系统的扫描电镜图像。结果表明，在纤维蛋白凝胶系统中矿物发生矿化的一分钟后就会发生核化，以及随着时间，矿物晶体颗粒生长和转化为针状结构（图5）。为了鉴别氟离子对晶体形态的影响，在加入不同浓度氟离子后，经过三天的矿化我们获得晶体的扫描显微图像。随着氟离子浓度的增加，可发现彩带般的OCP的晶体数量减少。最后，当氟离子浓度200 ppm时，针状晶体FAP覆盖整个晶区，如图6
溶解度实验
每个样品的溶解度被定义为在矿化凝胶系统中钙离子被洗脱的含量与最初的钙含量的比值。和预期一样，溶解度随氟离子浓度增加而增加。（图4）
图二，(A)在不同的PH下，凝胶扩散和溶液系统中产生的矿物X射线衍射图；（A至C）在溶液系统中矿物：（a）不受酸碱约束条件 ；（b）PH=7.4；（c）PH=9.0；（d到f）在凝胶系统中矿物：（d）不受酸碱约束条件 ；（e）PH=7.4；（f）PH=9.0；（B）在氟离子量为200ppm时，在不同的PH下，凝胶扩散系统中产生的矿物的X射线衍射图：（a）不受酸碱约束条件 ；（b）PH=7.4；（c）PH=9.0。
图3(A)在pH值为7.4时，不同氟化物浓度所获得矿物的X射线衍射图（B）矿化产品的（300）X射线反射图：（a）没有氟离子（b）氟离子浓度2ppm（c）（d）20ppm（e）50ppm（f）200ppm（g）500ppm（h）1000ppm（i）2000ppm。
图4.当pH7.4 氟化物浓度不同时，在纤维蛋白胶中所获得的矿物的结晶度（■）和溶解度（●）。结晶度定义为在（002）峰逆半值宽度，在凝胶的矿物质溶解度定义为在复合凝胶中钙离子的洗脱的含量比最初的钙含量。
讨论
为了改善有机/无机复合材料的机械性能，生物降解性，在过去的几十年中，生物相容性，许多研究已经开始进行了。本次研究中，我们建立了一个制备有机/无机纤维蛋白的方法：通过使用钙溶液和PO4溶液双向扩散方式制成纤维蛋白胶。我们也证明了这种复合材料的矿物相的特征可通过改变pH值和氟离子的浓度而控制。
首先，我们比较了在凝胶扩散系统和溶液系统中形成的矿物特征。在凝胶扩散系统中生成的矿物的结晶度比在溶液中生成系统中较高。纤维蛋白胶是由一个个小纤维网络结构组成的，在凝胶系统中这种结构可能减轻离子扩散速率和促进晶体增长。在不含氟离子的情况下，在凝胶扩散系统中，当不受酸碱约束下获得的矿物是DCPD；当PH是7.4时，获得的矿物是DCPD和OCP的混合物；当PH是9.0时，获得的矿物是OPD和HAP的混合物。以前的报告表明DCPD合成的最适当的pH值条件是酸性的，对于OCP，它是中性偏弱酸性，对于HAP，它是中性偏弱碱性。在矿化期间，凝胶系统的pH值下降可能是由于目前产生的结果造成的。
虽然当PH为9.0时，在矿化中可以获得羟基磷灰石类矿物，但是获得的矿物的结晶度仍然很低。为了控制生成的矿物结晶度，我们研究了在凝胶系统中氟离子对矿化作用的影响。有趣的是，当氟离子浓度为200 ppm时，无论PH值为多少，X射线衍射轮廓表明HAP/ FAP的类均具有高的结晶度。这一结果表明，氟离子可促进磷灰石晶体的稳定性和抑制以形成的晶体的变形和水化。
由于在生物硬组织中氟离子的浓度较高，而且在牙釉质形成期阶段氟离子的吸收量也是最高的。我们的结果也证实了猜想：在生物矿化过程中，增强羟基磷灰石生物矿化的结晶度，氟化物含量是一个关键因素。然后，我们研究了在凝胶系统中氟离子浓度对矿物形成的影响。随着氟离子浓度从2-500的增加，凝胶系统中矿物特征也在改变，从在OCP/HAP复合材料到HAP/ FAP复合材料。随后，当氟离子的浓度超过500ppm时，凝胶系统中将会形成氟化钙。在有机/无机复合材料中控制无机相的结晶度和溶解度将有利于其降解调控，因为纤维蛋白胶具有生物降解性能。为了了解这种复合材料的结晶度和溶解度之间的关系，我们研究了当氟离子的浓度（0-200 ppm）变化时，该材料不同的矿物形成的溶解度。所获得的矿物结晶度随着氟离子浓度的增加而提高，以及溶解度表现出与结晶度负相关的关系。
在骨组织再生过程中，最重要的是要控制新植入骨组织的生物降解性材料的生物降解性。我们建立了一种新的仿生材料制备方法，纤维蛋白和钙磷酸盐复合。并显示矿物的特征和结晶度可以有制备条件控制。这种有机/无机材料在矿化过程中多样的特征将有助于理想的骨组织再生过程控制其生物降解性以配合适的治疗。
图5，在pH7.4，氟化物浓度为20 ppm时，晶体生长的扫描电镜图像，（A）纤维蛋白凝胶；B）1分钟矿化后；（C）30分钟矿化后；（D）6小时矿化后。
图6，在pH7.4，氟化物浓度为不同时矿物晶体的扫描电镜图像：（A）0 ppm，（B）2 ppm，（C）20ppm，（D）200 ppm
