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RNA纯化常见问题和解决方案
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RNA纯化常见问题和解决方案 1 RNA降解 A 新鲜细胞
如果试剂没有问题，且外援性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
B 新鲜组织
某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
C 冷冻样品
样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃并相中保存，样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在年末碾磨过程中要及时补充液氮，样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
D 外源RNA酶的污染
试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。配置溶液用的酒精，异丙醇和Tris等应采用未开封的新瓶。避免使用一次性塑料手套，塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNAse污染区和RNAse-free处传递RNAse，扩大污染。
E 内源DNA酶的污染
抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多，匀浆时温度过高。2 OD260/OD280偏低 A 蛋白质残留
使用酚氯仿抽提，去除残留的蛋白质（但经此步骤操作，约损失40%的RNA）B 盐分残留
加入2.5倍体积的污水乙醇和终浓度时0.1M的NaCl沉淀RNA，-20℃放置30分钟充分沉淀RNA，然后4℃下10000g离心15分钟收集沉淀，溶于DEPC处理过的水中。
C 设备限制 测定OD260和OD280数值时，使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。稀释样品测定OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH8.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。RNA提取得率低
A 使用样品过多，超过吸附柱的最大结合量 使用过多的样品，将会导致RNA的降解。B Wash Buffer中未加入无水乙醇 C 洗脱不正确
加入洗脱buffer后，放置2-3分钟再进行离心洗脱。D 样品中RNA本身含量低 增加样品用量和裂解液用量
E 电泳检测时，换用新的电泳缓冲液，并尽量减少电泳时间。4 基因组污染
A RT-PCR反应中，使用过量的RNA
减少RT-PCR反应中RNA模板的量至50-100ng B 使用过多的组织
使用过多的组织将会导致大量基因组DNA的污染，减少起始组织样品的量。大部分组织采用30mg，或者更少量的组织不会出现基因组的污染。
C 增加裂解缓冲液的用量
D 对有些本身DNA含量过多的样品，可使用RNAse-free的DNAse I处理后进行后续实验。乙醇残留
洗脱前应保证乙醇去除干净，可将吸附柱开盖离心2分钟。6 柱子堵塞
A 裂解不完全，或者匀浆不彻底
减少起始样品的量，或者增加裂解缓冲液的量，并增加裂解时间。B 上清中含有沉淀
吸取上清时，小心操作避免吸起沉淀。
