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蚕丝蛋白生物医学材料的研究进展
摘要
主要介绍蚕丝蛋白的结构，制备已经在生物医学材料上的应用优势。针对蚕丝蛋白的结构和特点，综述了蚕丝蛋白作为人工神经、皮肤、骨骼、血管、肌腱、韧带和角膜等生物医学材料的功能开发和研究现状。关键词：蚕丝蛋白 丝素 丝胶 生物相容性 生物医学材料
Abstract Mainly introduces the structure of silk protein, the preparation has application in biomedical materials.Silk protein is a natural polymer material with good mechanical properties，chemical properties，biodegradability and good compatibility with human body．It is a good biomedical material．In view of the structure and characteristics of silk protein，this paper reviewed the status quo and development of silk protein as artificial nerve，skin，bones，blood veels，tendons，ligaments，cornea and other features of biomedical materials，as while discued the prospects for their development．
Key word：silk protein；fibroin ；sericin ；Biocompatibility；biomedical material
引言
蚕丝是一种天然纤维，是人类最早利用的动物纤维之一，在我国具有悠久的历史，享有―纤维皇后‖的美誉。传统意义上，蚕丝是优质的服饰原料。随着对蚕丝显微结构的深入研究发现，其用途不断扩大，产品种类日益增多。现在，蚕丝不仅用作高档服饰的面料，还在食品、化妆品、保健品以及医学等方面有着广泛的应用[1]。特别是随着现代组织医学的发展，丝素蛋白以其良好的生物相容性和生物降解性成为人工组织材料中的重要天然材料。
目前，我国是世界上家蚕丝及柞蚕丝产量最大的国家，家蚕生丝产量约占世界一半。对其进行详细的研究，无论是从基础科学还是从应用科学来看，都是很有意义的。
蚕丝蛋白的结构
家蚕丝蛋白由家蚕体内的绢丝腺合成、分泌，主要成分是丝素和丝胶，约占蚕丝总重量的97，此外还含有少量的蜡、色素、碳水化合物和无机成分等，诸类少量物质大部分分布于丝胶中。蚕丝丝素和丝胶都是蛋白质，一般说来，丝素蛋白含量约占蚕丝的70～80，丝胶则为20～30[2]。
丝素蛋白中包含18种氨基酸，其中侧基较为简单的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)约占总组成的85％，三者的摩尔比为4:3:1，并且按一定的序列结构排列成较为规整的链段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域；而带有较大侧基的苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)等主要存在于非晶区域。另外，蚕丝蛋白还含有钾、钙、硅、锶、磷、铁和铜等多种无机元素。因此，蚕丝蛋白在应用方面具有很大的灵活性。
蚕丝蛋白在生物医学应用方面的优势
蚕丝蛋白具有非常好的生物相容性[3]，首先，作为组织的替代品，人工材料首先应具有较好的生物相容性，并适宜细胞的附着、延伸和繁殖。生物相容性是由材料本身和结构决定的，一般分为材料表面的生物相容性和结构相容性两方面，表面相容性由材料表面的化学性质控制，影响细胞的贴附和延伸[4]；结构上的生物相容性是指材料在空间结构上影响细胞的生长和繁殖。大量研究发现骨髓细胞能在丝素载体上正常生长。Ronald E Unger[5]等在纯丝素膜上培养来源于人体不同组织的不同细胞，如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞等，扫描电镜观察发现，所有的细胞都能在丝素膜表面贴附、延伸，细胞之间联系紧密。其中绝大多数细胞能在丝素膜表面存活，并覆盖于整个膜表面和材料表面的凹陷，细胞的生长对材料的结构并无改变。
另外蚕丝蛋白还有很好的可降解性，材料的降解性也是衡量其能否作为组织替代品的标准之一。理想的人工组织材料应具有与修复区组织细胞生长一致的降解速率。同时，不能降低相关的力学性能，这样才能为新生组织提供相应的力学支撑。
降解后的单体不造成组织免疫反应。研究表明：植入活体的丝素纤维，2个月内，其力学强度仍高于植入前力学强度的50％[6]。植入体内的蚕丝在一年里仍保持一定张力，而完全分解大约需要2年[7]。所以，蚕丝作为一种蛋白质是可以降解的，并且植入人体内最终也会被吸收，只是降解时间比一般意义上的可降解 材料要长。与当前的人工材料，如聚乳酸、聚乙二醇等相比，丝素的降解产物为小分子氨基酸，安全性更高，而人工材料的降解产物会通过降低环境的pH值而产生明显的炎症反应。胶原蛋白作为当前研究最广泛的天然材料，在降解过程中同样无炎症反应，但降解的速度受到交联度影响，导致降解速度不易控制。
蚕丝蛋白的制备皂碱精炼法
蚕丝能被开发利用，除了它能被水解成氨基酸外，还有一个非常重要的特征是，蚕丝(丝素)在某些中性盐(如溴化锂、氯化钙等)的高浓度溶液中，当溶液温度升到一定程度时，蚕丝会被溶解，通过透析、超滤等处理脱除中性盐后，就能得到纯度较高的丝素溶液[8]。日本钟纺株式会社，采用中空纤维超滤装置(要求中空纤维的表面积与中空体积之比大于100)，可在短时间里，将丝素溶液中的盐透析干净。丝素溶液制备的流程如图1。
丝素水溶液是一种准稳定溶液，能再度形成丝素结晶。因此在丝素的水溶液中加入盐类、乙醇，或干燥，或调节pH至微酸性等，均容易发生再结晶，析出丝素或形成凝胶，选择恰当的方法，便能制成粉末、薄膜、凝胶纤维等各种形状。2 酸精炼法[9]
用酸精炼蚕丝能赋予其光泽和丝呜。酸的精炼作用是蛋白质的某个特定氨基酸侧链发生水解。丝素和丝胶蛋白质均受酸的作用．但稀酸对天冬氨酸、谷氨酸侧链的作用强，而天冬酸和谷氨酸在丝素中含量很小，分别为1.0—1.9mol和0.8～ 1.0mol％[10]。在丝胶中却很丰富，分别为14．6—16．7mol％和4 42—7．9mol％，由于这种含量的差异，稀酸优先作用于丝胶而完成精练。S．Blackburn等认为，蛋白质水解的机理如图2所示。目前，酸精炼主要采用酒石酸和柠檬酸。用酒石酸精炼，酒石酸能被丝有效地吸收，最大吸收量高达2．5％，其精炼的最佳条件为浓度8g／L，温度1IO。C，时间30min，非离子渗透剂(磺化脂肪酸衍生物DTC)3g／L。酶处理法[11]
近年来采用酶精炼或脱胶越来越受到重视。因为采用酶精炼不仅可以在较低的温度下进行，还可获得丝素不易损伤、不起毛丝和蓬松性好的效果。(1)蚕丝的酶处理
生物酶是一种无毒无害环境友好的生物催化剂，用于纺织工业具有很大的优越性，它处理需要的条件(温度pH等)较温和：酶用量少．且反应后释放的酶可继续催化另一反应；处理产生的废水可生物降解[12]，因此减少了污染，节约了能量。目前生物酶技术应用于纺织加工主要有两方面：一是用生物酶去除天然纤维或织物上的杂质，为后续染整加工创造条件；二是用生物酶去除纤维或织物表面的绒毛，或者使纤维减量，以改善织物的外观和手感。(2)蚕丝的酶脱胶[13]
酶精炼是丝胶溶胀后，丝胶蛋白质被蛋白质酶催化水解去除。蚕丝的酶脱胶是一种非常典型的酶减量、柔软、抛光和改善服用性能的加工。精炼脱胶后蚕丝的优良品质才能发挥出来，丝纤维表面光洁、透明，而且有很强的丝鸣感。加之蛋白
酶反映的专一性，这种酶处理对蚕丝的损伤很小，其精炼质量优于皂碱。
蚕丝蛋白的医用研究
随着对丝蛋白的不断深入研究，国内外研究者愈加地关注起丝素蛋白在药物缓释、抗凝血材料等方面的应用。在药物缓释方面，研究范畴主要围绕着载药缓释膜、药物缓释微球、药物缓释凝胶以及药物控释涂层等几个体系[14]。手术缝线是丝素在医药方面利用的最早产品之一。相对其他缝合材料，蚕丝的亲和力和适应性非常强，在伤口愈合后可被人体吸收降解，患者免受拆线的痛苦由于最初采用的蚕丝缝合线表面仍残留部分丝胶，引起炎症反应，所以在过去仅限于小范围使用，并未得到推广。直至近年，人们对蚕丝的应用研究才逐渐扩大和深。人造皮肤[15]
人体的皮肤分为三层：表皮、真皮、皮下组织。重度烧伤的患者，皮肤会受到严重损伤，没有了皮肤的保护，患者体内的液体会大量地渗出、蒸发、丢失，这种情况往往会对患者的生命造成威胁，而更让人担心的是细菌感染旧。人体对自己的皮肤不会排斥，而对于任何来自外来的异己皮、异种皮、人造皮都会产生免疫反应，因而所有的植皮材料只能作为一种敷料，这就好像是给我们的皮肤提供了一个适宜生长的―土壤‖。除此之外，我们还必须将自己完好的皮肤―微粒‖播撒在―土壤‖中，在以敷料为―土壤‖的环境中，这些―微粒‖细胞才可以逐渐扩散、增殖，最后使创面完全愈合。
理想的人造皮肤，应具有以下特性：无抗原性、无毒、良好的细胞相容性、透气透水性好、对创面的粘合力强、可塑性强等一系列优点。目前植皮主要用小白猪真皮当做敷料，但是它的安全性较低[16]。2006年，闵思佳提取蚕丝中的蛋白质，制成蚕丝人造皮肤。这种人造皮肤明显优于其他材质的人造皮，它既光滑，又平整，柔韧性也很强。而且，与猪皮材料相比，它的安全性更高。蚕丝蛋白人造皮肤乍一看像混沌皮，在显微镜下却能看到它的表面有许多多孔的海绵状的细微结构，用手拉韧性十足阳。科研人员曾选取了15只大白兔，分5批进行动物实验，实验发现，贴上人造皮肤后，不到20 d兔子身上直径3cm的创口就愈合了[17]。2 人工神经
神经创伤修复是当今医学的一大难题。由于创伤、疾病等造成的不规则神经创面，恢复过程中如果缺乏必需的填充物，将导致神经瘤的形成。因此，自体移植到目前为止仍被认为是最有效的修复方法[18]。长期以来由于供体的严重匮乏，以及替代材料的研究进展缓慢，致使大量患者得不到及时有效的治疗。修复神经的非神经材料有硅胶管、骨骼肌、动脉或静脉血管和几丁质等。近十年的研究表明理想的神经修复材料必须具备以下条件：一是替代品需完全降解、无组织毒性，且能促进神经细胞的再生。非降解性材料需通过后期手术取出。二是人工神经在受体中存在较长时间来满足再生轴突通过远端吻合口。三是替代品有足够的空间和表面通透性，满足雪旺细胞的生长和营养物质的运输[19]。
科学家在丝素纤维上和丝素提取液中分别培养鼠背根神经和坐骨神经，通过与对照比较发现，丝素对2种细胞的存活和生长无负面效应，这为丝素作为神经材料的开发奠定了基础[20]。还通过对丝素、自体移植材料和缺损空白材料在6个月内对雄性鼠坐骨神经缺损的修复效果的对比发现，含有丝素纤维的丝素修复材料不但具有较好的机械性能和可渗透性，而且修复效果接近自体移植。由此表明：丝素在神经修复材料中具有较高的应用价值。3 人工骨骼
骨的修复必需有种子细胞、支架材料和生物调节因子3个要素[21]。目前骨修复已经不仅仅用于治疗骨损伤和骨缺损，还包括医疗整形。传统的内源性骨修复是医生从病人身体的其他部位取骨来修补受损的骨骼。丝素具有良好的机械性能和理化性质，可调节的生物降解性，生物相容性好，无毒、无刺激性等优点，已逐步成为人工骨的一种重要材料来源[22]。另外，蚕丝蛋白中大量的羧基与羟基能与钙离子紧密结合并诱导羟基磷灰石在其上结晶形成自组装纳米复合材料。而这种表面粗糙、多孔的刚性支架，有利于骨髓间充质干细胞分化为骨样组织。此外，通过实验证明其体内免疫反应较低，表明了这种丝纤维加固复合材料具有组织相容性，是作为骨组织替代工程的良好材料。4 人造肌腱和韧带[23]
肌腱和韧带分别是连接骨与肌肉、骨与骨的致密结缔组织。其功能为加强、维护关节在运动中的稳定。当肌腱和韧带被牵拉而超过其生理耐受范围时，即会发生不同程度的损伤。而肌腱、韧带的断裂或缺损尤其是运动员在生涯中不可避免的伤痛。治疗和修复肌腱和韧带，也一直是骨科的一大难题。临床上修复断裂的韧带常是直接缝合，但这样就缩短了其原有的长度，限制了关节的活动范围；钢丝固定也因相容性和弹性等原因，造成了后续生活上的诸多不便。因而，人造肌腱和韧带的开发成为了医学、材料学上关注的问题[24]。通过研究发现，蚕丝的强度和弹性系数与人体肌腱非常接近。且其良好的生物相容性、亲和性以及与介导细胞信号转导的性能，有利于开发人造肌腱和韧带。同样利用蚕丝蛋白的羟基、羧基与钙离子结合诱导生物骨质成分中的羟基磷灰石结晶的原理制成的复合材料也适用于人造肌腱和韧带。玉田靖等[埔在蚕丝蛋白中导人带电化合物[25]，6 发现处理过的蚕丝蛋白中钙的凝集量比未处理的有大幅增加，尤其导人磷酸基的蚕丝蛋白中钙的凝聚量要高出10倍以上。且经x射线透射检验，验证其含有人骨的主要成分，证明蚕丝具有肌腱和韧带的骨附着和结合特性，为进一步开发人造肌腱和韧带打下了基础。5 人工血管和抗凝血材料
人工血管材料不但应具有较好的生物相容性，也应具有与人体血管相适应的力学性能，才能保证其能顺利植入体内，在体内保持通畅，还应具有顺应性和可灭菌性[26]。目前所使用的人工血管根据材质可分为：合成血管、生物血管、表面改性人工血管和支架血管。合成血管主要由惰性高分子合成，是当前应用最多的人造血管，如Dacron(涤纶)、e—PTFE(膨化聚四氟乙烯膜)和PU(聚氨酯)等[27]。前者抗凝结性较弱，易形成血栓，引起严重的炎症反应。生物血管主要指自体、异体和异种血管。表面改性血管主要是通过物理、化学或生物方法对血管改性，使其更适用于人体环境。而支架血管主要是通过在金属支架外套上一层血管膜来提高其生物相容性。上述人工血管各有优势，而最大的不足在于大多数不具有生物降解性，或是降解后的产物会引起受体的炎症反应。王维慈等通过对几种临床常用的人造血管生物材料和丝素蛋白改性聚氨酯材料SF-PU(1:1)在大鼠体内引起的急性期组织反应的对比证实，SF—PU(1:1)材料的组织相容性最好，加之SF-PU(1:1)具有优异的物理性能，因此在小口径人造血管的研制方面有很好的应用前景。
蚕丝具有较好的机械性能，并可根据实际需要制备获得需要的形态。但蚕丝的抗凝血性不佳，影响了蚕丝在组织工程中的应用。因此考虑在保持蚕丝优势的前提下，通过在蚕丝表面接枝抗凝血因子，来提高其抗凝血效果。
研究展望
现代人类文明高速发展，我国人民的生活水平日益提高，高品质的人体组织修复与替代材料的开发显得尤为迫切。人工组织材料不仅具有良好的机械性能[29]，并且可以运用丰富的加工手段，通过对材料空间结构和性能的改变调节降解速度。蚕丝以其良好的机械性能、生物相容性和易于加工性，在组织工程材料中得到越来越广泛的应用。目前，蚕丝蛋白作为重要的医用仿生材料之一[30]，其研究与利用还十分有限，许多作用机理至今还不明确。所以，基于蚕丝蛋白的医用仿生材料研究还任重道远。参考文献：
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