生物工程导论论文由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“包装工程导论论文”。
基因工程在生物医药方面的应用
嘻嘻嘻
生工121
1指导老师： ddd老师
摘要：20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。关键词：基因工程，生物医药，实验设计
前言
20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。
1.基因工程在生物医药领域就有巨大的应用潜力：
20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。据不完全统计，欧美诸国目前已经上市的基因工程药物近100种，还有约300种药物正在临床试验阶段，处于研究和开发中的品种约2000个。值得注意的是，近两年基因药物上市的周期明显缩短。与一般药物研究开发相比，基因工程药物研究投入大。在美国，这种药物的研究经费是工业研究平均投入的近10倍，且呈逐年增加的趋势。一些大的跨国公司为垄断市场而冒险涉足，如美国强生公司为开发一个重组人红细胞生成素(EPO)产品，投资≥20亿美元，获利也十分丰厚。
2.目前国内外通过基因工程技术研制的主要的生物制剂或药物：
.转基因植物基因工程疫苗
目前的蛋白质疫苗主要是通过重组细胞培养系统生产的基因工程疫苗，但这些系统需要发酵、纯化技术，其设备复杂，成本高，目前生产的疫苗也远不能满足全球免疫计划的需要，因此，1990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。.转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程药物 利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低，故近年不少研究者从事转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究。
.微生物发酵、动物细胞培养生产的基因工程药物 目前工业化生产基因工程药物主要采用微生物发酵、动物细胞培养技术。由于基因工程药物具有巨大的潜在市场，如美国基因工程药物销售额1995年为48亿美元，而1997年超过60亿美元，且每年以20%速度增长，故从1982年重组胰岛素批准上市以来，现已有近40种基因工程蛋白质药物投放市场，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿病、不孕症等疑难病。我国基因工程药物批准上市已有12种，批准进入临床试验有10余种，进行临床前研究有8种以上。至1997年底各国的基因工程药物批准进入I期临床试验的7种以上，II期临床试验18种以上，III期临床试验10种以上，批准上市39种以上，以外还有很多基因工程药物正在进行临床前研究，如IL(interleukin，白细胞素)-
5、IL-
15、抗IL-8抗体、抗IL-8受体抗体、神经生长因子、肝细胞生长因子等。
3.设计实验(以实现基因工程药物或制剂的研制)碱破裂法提取质粒DNA 第一：称取胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，NaCl 0.5g，放于100 ml的三角瓶或烧杯中，加入蒸馏水至50ml溶解。分装于20支10ml的试管中，每支约5ml加塞，包扎。以供班上部分。当培养基温度降至55-60℃时，在超净台上向两支试管中分别加入氨苄青霉素（Amp），终浓度为100 µg/ml。并且，在试管上写上与平板上对应的编号，约3管。
第二；用镊子夹取灭菌的牙签挑去少量对应编号的白色菌种的菌种，放入到LB液体培养液进行扩大培养。约挑去3个符合理论的电泳图谱的对应的白色菌落菌种。第三：在37℃摇菌过夜，然后利用碱破裂分别提取质粒。摇菌后的剩余菌液放在4℃保存。附：碱破裂法提取质粒操作过程
1)吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。2)离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）3)加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。6)离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。
9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。
10)离心(14 000rpm，10分钟，4℃)，倒掉上清液。
11)加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥
13）加20~30µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用。14)琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15）每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer混匀，进行点样。16）电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
2质粒DNA酶切电泳 第一： DNA浓度纯度的测定
空白测定：吸取200 µl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。
DNA测定：取质粒DNA 1 µl至一干净的离心管，加入199 µl蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。
第二：配制酶切反应液碱破裂法提取质粒DNA 第一：称取胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，NaCl 0.5g，放于100 ml的三角瓶或烧杯中，加入蒸馏水至50ml溶解。分装于20支10ml的试管中，每支约5ml加塞，包扎。以供班上部分。当培养基温度降至55-60℃时，在超净台上向两支试管中分别加入氨苄青霉素（Amp），终浓度为100 µg/ml。并且，在试管上写上与平板上对应的编号，约3管。
第二；用镊子夹取灭菌的牙签挑去少量对应编号的白色菌种的菌种，放入到LB液体培养液进行扩大培养。约挑去3个符合理论的电泳图谱的对应的白色菌落菌种。第三：在37℃摇菌过夜，然后利用碱破裂分别提取质粒。摇菌后的剩余菌液放在4℃保存。附：碱破裂法提取质粒操作过程
1)吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。2)离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）3)加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。6)离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。
9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。
10)离心(14 000rpm，10分钟，4℃)，倒掉上清液。
11)加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥
13）加20~30µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用。14)琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15）每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer混匀，进行点样。
16）电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
2质粒DNA酶切电泳 第一： DNA浓度纯度的测定
空白测定：吸取200 µl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。
DNA测定：取质粒DNA 1 µl至一干净的离心管，加入199 µl蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280第二：配制酶切反应液碱破裂法提取质粒DNA 第一：称取胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，NaCl 0.5g，放于100 ml的三角瓶或烧杯中，加入蒸馏水至50ml溶解。分装于20支10ml的试管中，每支约5ml加塞，包扎。以供班上部分。当培养基温度降至55-60℃时，在超净台上向两支试管中分别加入氨苄青霉素（Amp），终浓度为100 µg/ml。并且，在试管上写上与平板上对应的编号，约3管。
第二；用镊子夹取灭菌的牙签挑去少量对应编号的白色菌种的菌种，放入到LB液体培养液进行扩大培养。约挑去3个符合理论的电泳图谱的对应的白色菌落菌种。第三：在37℃摇菌过夜，然后利用碱破裂分别提取质粒。摇菌后的剩余菌液放在4℃保存。附：碱破裂法提取质粒操作过程
1)吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。2)离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）3)加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。6)离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。
9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水10)离心(14 000rpm，10分钟，4℃)，倒掉上清液。
11)加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥
13）加20~30µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用。14)琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15）每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer混匀，进行点样。
16）电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
质粒DNA酶切电泳 第一： DNA浓度纯度的测定
空白测定：吸取200 µl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。
DNA测定：取质粒DNA 1 µl至一干净的离心管，加入199 µl蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。
第二：配制酶切反应液
第三：反应结束后，向反应液中加入4μl 6×loading buffer，混匀以停止酶切反应，所有24μl样品均点在同一个点样孔中。在以下条件下：120V,45分钟左右进行电泳。第四：
菌种的利用和保藏
经鉴定并判断正确的质粒，取其对应编号的原菌液，按照需要进行扩大培养，或者取菌液500μl和500μl甘油混合进行超低温（-80℃）保藏。
参考文献：百度百科及陈阅增普通生 物学及上海公共研发平台相关指导
