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南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 组织切片技术注意事项
程序步骤
1、取材
2、固定（固定24h—1W）
3、包埋
石蜡切片：流水冲洗组织块>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蜡2h>>包埋
冰冻切片：固定后的组织>>OCT包埋>>切片或-20度保存；
液氮中的组织>>转入-20度>>OCT包埋>>切片或保存
4、切片
切片>>展片（40~50度）>>贴片>>干燥（37度过夜或者50~60度2h）
5、HE染色
干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸馏水3min>>苏木精染色30s—5min>>自来水涮洗>>蒸馏水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊红染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性树胶封片
6、免疫组化（ABC法）
（1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水；
（2）双氧水（1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶；
（3）PBS洗涤3×5min；
（4）5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗；
（5）滴加适当稀释度的一抗；4度孵育过夜或37度2h；（6）同上洗涤；滴加二抗，37度1h；
（7）同上洗涤；滴加ABC复合物，37度1h；（8）洗涤5遍，每次5min；
（9）配制显色液（DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色；（10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色；（11）苏木精复染，脱水，封片。
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注意事项
取材
1.组织越新鲜越好，最好于动物处死后10~20min完成取材，时间过久后组织自溶和腐败会影响组织形态。
2.取材组织块不宜过大，一般为5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固定）。
3.取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。
4.如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定，2~4h后进行修块，即用锋利的刀片（刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。5.如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖学位置取材（比如十二指肠距胃3cm处，或空肠距胃10cm处）。
6.取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。7.一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋膜、脂肪等。
8.取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接冻存一般采取液氮中速冻，然后转入-20度保存，冻存组织应避免反复冻融，且尽快进行切片或用OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在-20度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。
9.理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋冻存。但对于抗原表达量大且较易检测的免疫组化，可以采取石蜡切片，但固定时间不能过长，控制在1周以内，长时间固定会引起抗原表位的醛基化和抗原表位构象变化，导致免疫组化检测灵敏度降低。
固定与包埋
1.选择合适的固定液，原则是在良好固定组织并保持形态的前提下尽可能的减小对组织的影响。常用固定液为福尔马林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后两者最为常用，效果也较好。
南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鲜配制，新配的固定液固定效果较好。3.固定液体积理论上应为组织体积的20倍以上。
4.一般组织理论固定时间为4~24h，即以固定液完全渗透进入组织的最短时间为宜，实际操作中可延长至数天，但一般控制在1周以内。
5.如果是冰冻切片，固定后的组织最好及时用OCT包埋，能更好的维持组织形态，包埋后的组织可于-20度保存数月。固定后的组织可用蔗糖溶液脱水，方法为直接将组织置于30%蔗糖溶液中，每天换新鲜蔗糖溶液，2-3天组织在蔗糖中沉底即可。一般来说，先固定，然后脱水，再用OCT包埋效果比较理想。6.冰冻切片可以采取后固定的方法。即采得的组织经液氮速冻后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰冻切片后用丙酮等对切片上的组织进行固定。但丙酮固定较为强烈，容易发生掉片。
7.石蜡切片时，固定后的组织包埋前一般对组织进行洗涤，通常用自来水冲洗，洗掉组织中的固定液，因为残留在组织中的固定液可能对染色产生影响。洗涤为可选步骤，我们实验室通常不洗涤，将固定后的组织直接包埋，并不影响HE染色效果。
8.二甲苯透明时间是影响包埋效果的最关键因素，需根据组织种类、组织大小、室温以及二甲苯的新旧程度综合考量，必要的时候需要设置时间梯度进行摸索。此外，组织是否脱水完全、是否浸蜡完全也直接影响包埋效果，原则上在能够完全脱水和浸蜡的前提下，组织在各溶剂中的浸泡时间越短越好。
切片
1.切片成功与否很大程度上取决于组织固定和包埋的好坏。
2.切片厚度：HE等组织学染色一般4~5微米（4微米差不多是石蜡切片的极限），如果切片困难，可适当增加切片厚度（20微米以内越厚越好切），但切片厚度的增加会使得细胞层数增多，影响观察和美观。免疫组化中石蜡切片一般切片5~10微米，冰冻切片大约8~14微米，特别是在检测表达量较少的抗原时，较厚的切片可以增加阳性物质的出现概率。
3.较好的石蜡切片呈均匀连续状，没有空洞和破损，组织完整不碎裂。4.切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。刀片应从一段开始使用，发现刀痕时逐渐移动，以最大限度使用刀片。
5.冰冻切片的主要影响因素有：切片机箱体温度（一般为-25度左右），防卷器位置（太往前切不动，太往后起不到防卷效果）。
6.对免疫组化切片而言，需对玻片进行包被（一般为使其带正电荷，组织带负
南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 电荷，通过静电吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太浅起不到粘附效果，包被太深会导致免疫组化非特异性染色。
展片和贴片（捞片）：
1.烧杯中装蒸馏水，置于水浴锅中，温度一般40~45度，温度太低片子展不开，温度太高石蜡会融化。
2.冰冻切片不需要展片，直接将玻片轻靠在组织上，组织便会自动吸附到玻片上。
3.捞片时选取完全展平的片子捞起，宁缺毋滥。一张玻片上可以贴多个组织，最后选染色效果好的封片，增加成功率。
4.未包被过的玻片可重复使用，包被过的玻片贴片后组织很难掉下，不可重复使用。
干燥：
1.干燥可以让组织贴的更结实。石蜡切片37度干燥过夜，或者45~60度干燥数小时。冰冻切片室温晾干（夏天一般5~10min），但不可凉太干，太干也容易掉片，判定标准为组织表面没有明显的液体为宜，如果组织变白说明干燥时间过长。
2.干燥后的石蜡切片可放切片盒中室温保存，如果天气炎热可以放置4度保存；冰冻切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期内试验可以放4度保存。
染色（以HE染色为例）：
1.液体置换要彻底，特别是脱蜡和脱水步骤。
2.伊红一般用醇溶性配方，苏木精配方有很多种，如果用氧化汞方法配制使用前要过滤，因为液体表面容易聚集一层金属离子薄膜，对染色产生影响。3.新鲜配制的伊红染色时间1秒即可，存放时间长的染液可以适当增加染色时间。
4.封片时中性树胶的量要适度。根据组织的大小选择大小合适的盖玻片，盖玻片以能覆盖住组织为前提，越小越好，太大的盖玻片溶液不平整，显微镜观察时组织可能不在一个平面，需要反复调整焦距。
5.苏木精和伊红染色时，最好摸索染色时间，以寻求最合适和漂亮的颜色搭配，不同的组织染色能力有所差异，比如淋巴组织内淋巴细胞较多，细胞核比较大，染出来可能蓝色居多，肌肉组织中肌显微和细胞质比例高，染出来红色
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6.总体原则是染色宁愿偏浅不要偏深，偏深的染色难以判别细胞形态和结构。
免疫组化注意事项：
1.免疫组化一般以冰冻切片为主，但石蜡切片也可以做免疫组化。
2.冰冻切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰冻包埋）。3.免疫组化步骤繁琐，时间较长，因此用包被过的切片来防止掉片。常用的包埋剂有APES，多聚赖氨酸和明胶等。包被过程相对简单，可购公司的商品包被试剂盒，按照说明书操作。
4.石蜡切片的免疫组化有时需要抗原修复。原因：固定液会对组织的抗原性产生影响，示抗原表位发生构象变化，可以通过化学处理和热处理来还原组织的抗原性。常用的修复液为枸橼酸钠缓冲液，一般采取热修复，即把切片放置在缓冲液中然后加热至沸腾。
5.免疫组化切片厚度一般为8~12微米。6.选择合适的抗体（单抗、多抗）。
7.预实验确定合适的H2O2、封闭液和抗体作用浓度和时间。8.选用包被过的玻片，动作轻柔，防止掉片。9.设置阳性、阴性和空白对照。
10.显微镜下控制显色，放置显色过浅或过深。
11.复染时苏木精浓度可稀释，时间缩短，避免染色过深。
12.遇到问题逐项排除，寻找原因。详细的问题解决和相关技术贴可参照丁香园论坛或生物秀论坛，搜素“免疫组化”可以找到相关资料。
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溶液配制
固定液
4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，边加入边加热搅拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促进粉末溶解，完全溶解后HCl调PH至7.4，4度保存。
Bouin氏液：75ml 饱和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混匀。
染液
伊红染液：1%醇溶性伊红配方为1g伊红加入到100ml 80%酒精中，溶解。
苏木精染液：
1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；
2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约10~20min；
3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；
4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。
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免疫组化
0.3%~1%双氧水：
商品化30%双氧水溶甲醇稀释到适当浓度。
1~5%BSA（羊血清、脱脂乳）： 0.01M PBS配制。
Triton-PBS：
100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混匀。
