动物细胞培养、计数、冷冻与复苏实验由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“自主实验动物细胞培养”。
动物细胞培养、计数、冷冻和复苏
实验报告
由于本次实验分三天进行，日期分别为10月31日（周一）、11月2日（周三）、11月4日（周五），实验内容分别为动物细胞培养、结束，动物细胞冷冻以及最后的动物细胞的复苏，又因为冷冻和复苏可视为连续环节，故本报告分成两个部分来记录本次实验，具体内容如下：
I.动物细胞的培养和计数
一、实验目的由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。
本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。
二、基本原理
动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。
体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。
体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。
动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。
动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动
物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为：
四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。
细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为： 活细胞数÷总细胞数×100％。
三、仪器、材料和试剂
1.超净工作台
2.倒置显微镜
3.二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为5％。
4.培养基：DMEM培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22μm滤膜除
菌过滤。
5.血清：Hyclone新生小牛血清。
6.PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。
7.胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25％，0.22μm滤膜除菌过滤。
8.玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。
9.血球计数板
10.移液枪
11.台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用。
四、实验步骤
1.贴附型细胞传代培养
（1）倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基；
（2）用10ml无菌PBS洗涤，倒掉；
（3）加入2ml胰酶溶液（0.25％），进行消化；
（4）显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形；
（5）倒掉胰酶；
（6）按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养
箱。
2.悬浮细胞传代培养
按贴附型细胞传代培养步骤（6）操作即可。
3.细胞计数
（1）将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙；
（2）待计数样品如果需要，用PBS进行稀释；
（3）取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液（0.4％），用滴管轻轻吹打混
合；
（4）用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平
台上完全充满细胞悬浮液，（5）显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度；
五、实验结果
通过倒置显微镜的观察计数，得出的结果是，在平台1上四个大方格得到的活细胞总数为206个，死细胞总数为0个，在平台2上四个大方格得到的活细胞总数为210个，死细胞总数为1个。
根据细胞数的计算公式：
四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。
可得到细胞总数为：
平台1:（206+0）×1×104÷4=5.15×105 细胞数/mL
平台2:（210+1）×1×104÷4=5.275×105 细胞数/mL
所以平台1上活细胞比率即细胞存活率为100%，平台2上活细胞比率即细胞存活率为1÷211=0.474%
六、讨论与分析
本次实验根据老师提供的讲义可明显发现几处需要注意的地方：
1.胰酶消化的程度必须掌握好，消化不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损；
2.在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮液溢出平台，同时不能出现气泡；
3.对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含25－50个细胞为合适；
4.对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方格内还是小半在方格内。
稀释实验时，存在不少问题，老师也在事后指出了，因为是垂直式超净工作台，所以在其中进行实验时，要时刻注意需要保持无菌的试剂瓶瓶口位置，不能有遮住瓶口的操作，否则就会有导致染菌的危险，另外，从注意事项2也同时可看出事先没有做好量的粗略估计也可能在实验过程当中造成意外的失误。
计数实验时可能由于对倒置显微镜不太熟练的原因，在计数上花费了不少的时间，这需要在以后的操作实验中不断练习，也同时可能是因为这个原因，计数可能存在一定的偏差，这也必须在今后的实验中注意。另外，从注意事项1和4中，可以看出消化的程度还有计数的方法都将影响到最后的实验结果与准确性，消化的程度更会直接影响细胞的存活率。
II.细胞的冷冻和复苏
一、实验目的细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的，它们常常会发生各种变异，表现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。因此，在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来，以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内具有结构和功能的稳定性和一致性。
本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方法。
二、基本原理
在动物细胞的组成成分中90％以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶，由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用二成为首选。
在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5－10％，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。
三、仪器、材料和试剂
1.程序降温仪
2.超净工作台
3.离心机
4.液氮罐
5.冻存液：10％DMSO＋10％小牛血清＋80％培养液
6.冻存管（无菌）
7.离心管
8.细胞培养操作用具包括方瓶、移液管、培养基等，无菌。
四、实验步骤
1.冷冻过程
（1）准备好分散良好的细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数；
（2）离心并将细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到6×106活细胞/ml；
（3）将细胞分装在冻存管中，每支1ml，旋紧冻存管盖子；
（4）静置30分钟，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡；
（5）将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃/min，－40℃后5℃/min，降温至－
100℃停止；
（6）将冻存管置于液氮罐（－196℃），长期保存。
2.复苏过程
（1）准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等（无菌），新鲜培养基；
（2）将冻存管从液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至冻存管内细胞悬浮液完全融
解，此过程约1－2分钟；
（3）在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管，加入10ml新鲜培养基，离心
（5min，1500rpm）；
倒掉上清液，将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。
五、实验讨论
因为冷冻和复苏的实验没有相关需要记录的数据，所以本部分跳过了实验结果这一节，直接进行讨论。这两次实验的注意事项为：
1.涉及和液氮相关的操作，应戴好防护手套以防冻伤；
2.冻存管盖子必须旋紧，否则液氮容易渗入冻存管内，这样不仅可能导致污染，而且
将严重损伤细胞。
可能由于老师考虑到实验过程中的危险性，并没有让我们进行有关于液氮的实验操作步骤，但这两项注意还是值得我思考和借鉴的。这两次实验的重点是冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中采用快速解冻，减少解冻过程所形成的局部渗透压波动对细胞产生伤害。如不注意这两点，会对细胞冻存和复苏后细胞的存活率带来影响。
其实这两次实验的主要内容基本都与垂直超净工作台有关，个人认为老师的用意也是在此，让我们了解实验室中动物细胞不论用在何处，无菌首先是第一位的，因为要考虑到动物细胞的生长周期较长，所以保持无菌操作的必要性就变得尤为重要。
最后，感谢老师提供的讲义，让我们省下不少寻找资料和预习实验的时间，也同时感谢老师一个星期的指导。
