17 病理学常用技术的原理及应用由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“17病理学试题与及答案”。
第十七章病理学常用技术的原理及应用
第一节大体与组织和细胞病理学技术(一)大体观察
主要运用肉眼或辅以放大镜、量尺和磅秤等工具．对大体标本的病变性状(形状、大小、重量、色泽、质地、界限、表面及切面形态、与周围组织和器官的关系等)进行细致地剖检、观察、测量、取材和记录，必要时可摄影留作资料。大体观察不仅是病理医师的基本功和正确病理诊断的第一步。也是医学生学习病理学的主要方法之一。(二)组织病理学观察
将肉眼确定为病变的组织取材后，以福尔马林(fOmlahn，甲醛)溶液固定和石蜡包埋制成切片，经不同的方法染色后用光学显微镜观察。通过分析、综合病变特点，作出疾病的病理诊断。组织切片最常用的染色方法是苏木素一伊红(}~ematoxylin antl eosin，HE)染色。迄今，这种传统的方法仍然是诊断和研究疾病最基本和最常用的方法。若仍不能做出诊断或需要进一步研究时，则可辅以一些特殊染色、免疫组化和其他观察技术。(三)细胞病理学观察
通过采集病变处的细胞，涂片染色后进行观察、诊断。细胞的来源可以是运用各种采集器在口腔、食管、鼻咽部、女性生殖道等病变部位直接采集的脱落细胞，也可以是自然分泌物(如痰、乳腺溢液、前列腺液)、体液(胸腹腔积液、心包积液和脑积液)及排泄物(如尿)中的细胞，以及通过内镜采集的细胞或用细针直接穿刺病变部位(如乳腺、甲状腺、前列腺、淋巴结、胰腺、肝、肾等)，即细针穿刺(fine neecUe aspiI-ation，FNlA)所吸取的细胞。细胞学检查除了用于病人外，还用于肿瘤的普查。该方法设备简单，操作简便，病人痛苦少易于接受，但最后确定是否为恶性病变尚需进一步经活检证实。此外，细胞学检查还可用于对激素水平的测定(如阴道脱落细胞涂片)及为细胞培养和DNA提取’等提供标本。
第二节 组织化学与免疫组织化学技术(一)组织化学(histochemistry)一般称为特殊染色，通过应用某些能与组织或细胞的化学成分进行特异性结合的显色试剂．定位地显示病变组织、细胞的特殊化学成分(如蛋白质、酶类、核酸、糖类、脂类等)，同时又能保存组织原有的形态改变，达到形态与代谢的结合。如用过碘酸schiff反应(PAS)显示细胞内糖原的变化；用苏丹Ⅲ染色显示细胞内的脂肪滴等。在肿瘤的诊断和鉴别诊断中也可用特殊染色方法。如用PAS染色可区别骨Ewing肉瘤和恶性淋巴瘤，前者含有糖原而呈阳性，后者不含糖原呈阴性；用磷钨酸苏木素(PTAH)染色可显示横纹肌肉瘤中瘤细胞胞质内的横纹。
(二)免疫组织化学与免疫细胞化学(irrlmLJnohistochem‘lst吖and imrTlUrlOCytOCrlelTlistry)免疫组织化学(免疫组化)和免疫细胞化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，由免疫学和传统的组织化学相结合而形成。免疫组化染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，同时具有将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上原位确定某些蛋白质或多肽类物质的存在的特点，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析技术或激光扫描共聚焦显微技术等，可对被检测物质进行定量分析。
1．免疫组化染色方法和检测系统 免疫组化染色方法有很多，按标记物的性质可分为荧光法(荧光素标记)、酶法(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)、免疫金银及铁标记技术等：按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原一抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物(1abeled dextran polymer’，LDP)法．以及亲和连接，如ABC法、标记的链亲和素一生物素(1abeled streptavidin—biotin．LSAB)法等，其中LSAB法和LDP法是最常使用的方法。两步LDP法即Envision法．具有省时、操作简便、受内源性生物素干扰少等优点，但成本高于LSAB法。免疫组化染色常用的检测显示系统见表17—1。最常用的检测显示系统是辣根过氧化物酶(HRP)一二甲基联苯胺(DAB)系统，阳性信号呈棕色细颗粒状。2．免疫组化染色的反应结果和质量控制 免疫组化中常见的抗原表达模式有以下几种(图17—1)：①细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞分化抗原定位于细胞膜，如c1920、CD3等的标记呈细胞膜线性阳性反应；②细胞质的阳性反应，根据抗原的亚细胞结构定位不同，又有数种表现形式，如细胞角蛋白(cytoker。atin，cK)以及一些中间丝蛋白(vimentirl)。主要分布在近细胞膜处的胞质内；cDl5和cD30等抗体的染色呈胞质内局限性点状阳性反应；bcl一2蛋白等定位于线粒体的抗原常表现为细胞质内弥漫性阳性反应；③细胞核阳性反应，如I(i一67、雌激素受体(ER．)蛋白、孕激素受体(PR)蛋白等。有些抗体可同时出现细胞质和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈细胞膜阳性和胞质内弥漫性阳性反应，cDl5和(]D30抗体可同时呈细胞膜阳性和胞质内点状阳性反应等。
影响免疫组化染色质量的因素很多，在实验过程中应注意组织的取材和固定，选择高质量的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，规范技术操作，合理设立对照等。假阴性反应见于组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低，或固定剂使用不当，抗体质量不佳或稀释度不当等；反之，由于抗体与非待检抗原发生交叉反应，或组织对抗体的非特异性吸附以及内源性过氧化酶(endogenous per’oxidase)未被阻断等则可出现假阳性结果。这些都可能造成判断的失误。
3．免疫组化染色技术的应用 随着大量商品化的单克隆和多克隆抗体的出现。配套试剂盒的使用及方法学的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和临床病理诊断中应用最为广泛的病理技术手段之一。免疫组化技术可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药基因蛋白表达的检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。目前。免疫组化染色已经成为病理诊断中必不可少的检测手段。下述的非放射性原位杂交、原位PcR和原位末端标记DNA片段等技术也是在免疫组化染色技术的基础上发展起来的。
第三节 电子显微镜技术
1931年德国的Knoll和R。tska研制成功了世界上第一台电子显微镜，通过由电子束和电子透镜组合成的电子光学系统的多极放大后，可以将微小物体放大成像，极大地提高了分辨率。普通光学显微镜的分辨极限是0．2斗m，而目前最好的电镜的分辨率可达0．14nm，有效放大倍数为100万倍。透射电子显微镜(translm‘SSl‘On electron micr，oscope，TEM)是最早、最广泛应用于医学领域的一种电镜，之后又相继诞生了扫描电镜、超高压电镜等。电子显微镜和光学显微镜的基本原理相同，不同的是光镜的照明源是可见光，而电镜是以电子束为光源。电镜的透镜不是玻璃而是轴对称的电场或磁场。电镜技术使病理学对疾病的认识从组织、细胞水平深入到细胞内超微结构水平，观察到了细胞膜、细胞器和细胞核的细微结构及其病理变化，大大开阔了人们的视野，并由此产生了亚细胞结构病理学(刚hcelhalat’stnlcture pathology)，又称超微结构病理学(ultrastr．uCtural pathology)。
由于电镜的分辨率高，因此电镜样本的处理和超薄切片的制作技术比光镜制片更为精细和复杂．但基本过程相似，仍包括组织取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色等。电镜样本的制备与常规病理制片不同之处有：①要求组织新鲜，选择有代表性的区域进行小块多点取材；②双重组织固定，常用的化学固定剂有锇酸、醛类固定剂和高锰酸钾等；③环氧树脂包埋；④半薄切片经染色进行组织定位后再切制超薄切片；⑤重金属盐如醋酸铀或枸橼酸铅等染色。
电镜技术在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的观察和研究，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点(图17—
2、图17—3)；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断；疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定。如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断。随着电镜技术的，不断发展以及与其他方法的综合使用，还出现了免疫电镜技术、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微技术等。但电镜技术也有其局限性，如设备昂贵、样本制作较复杂；样本取材少。观察范围有限，有时还可能会遗漏信息：当用于辅助肿瘤的病理诊断时，只能判定肿瘤的组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性。
第四节 显微切割技术“ 显傲切割术(nLICI·odiection)是20世纪90年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞(图17—4)。再进行如PcR、PcR—SS(：P及比较基因组杂交等有关的分子水平的研究。
用于显微切割的组织切片可以是冷冻切片、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片。切片的厚度可为4～10斗m，冷冻切片需经甲醛或乙醇固定。另外，用于显微切割的组织切片还必须染色，以便于进行目标细胞群或单一细胞的定位。染色可以用普通方法，如甲基绿、核固红、瑞氏染液或苏木素等，也可用免疫组化染色，如要切割霍奇金淋巴瘤组织切片上的R—S细胞时，可用cDl5或cD30单克隆抗体染色进行靶细胞示踪。显微切割的方法有手工操作法和激光捕获显微切割法。激光捕获显微切割(1asel‘capture microdiection，LcM)技术的基本原理是：将组织切片放在倒置显微镜的载物台上，并在切片表面覆盖一层乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate；EVA)薄膜。激光束从切片的上方垂直照射下来。使其光路与显微镜聚光器的光路共轴，光斑恰好落在显微镜视野中心，即要切割的区域。该区的．EVA膜揭起来，与之相连的细胞也随之被完好地从切片上切割下来。将带有细胞的。EVA膜放入试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也将细胞裂解，获得待提取物质．如DNA、RNA和蛋白质等。
显微切割术的特点是可从构成复杂的组织中获得某一特定的同类细胞群或单个细胞。尤其适用于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较研究以及肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。该技术的不足之处是手工操作法的技术难度大；用LCM虽然操作简便，耗时少，取材准确，但需特殊的设备，激光器造价高。
第五节 激光扫描共聚焦显微技术
激光扫描共聚焦显微镜(1aser scanning confocal microscope，LSCM)是近代生物医学图像分析仪器研究最重要的成就之一，它是将光学显微镜、激光扫描技术和计算机图像处理技术相结合而形成的高技术设备。其主要部件有激光器、扫描头、显微镜和计算机等。共聚焦成像利用照明点与探测点共轭这一特性，可有效抑制同一聚焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品的非焦平面荧光，从而获得普通光学显微镜无法达到的分辨率。同时具有深度识别能力(最大深度一般为200～4()0仙m)及纵向分辨率，因而能看到较厚生物样本中的细节。(一)LSCM的主要功能
LscM的主要功能有：①细胞、组织光学切片：利用计算机及图像处理系统对组织、细胞及亚细胞结构进行断层扫描，该功能也被形象地称为“细胞CT”或“显微CT”(图17—5)；②三维立体空间结构重建；③对活细胞的长时间观察；④细胞内酸碱度及细胞离子的定量测定；⑤荧光漂白恢复技术(1]uol·eSCeDCe recovery after-photcIbleachinR．FRAP)：它利用高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，造成该区域荧光分子的漂白．而该区域周围的非漂白荧光分子将以一定速率向受照射区扩散，Ls(2M可直接对其扩散速率进行监测。FRAP可用于细胞间通讯、细胞骨架的构成、生物膜结构和大分子组装等的研究；⑥细胞间通讯的研究；⑦细胞膜流动件测定和光活化技术等。
(二)LSCM对样本的要求及其局限性
用于LscM的样本最好是培养细胞样本，如培养细胞涂片或细胞爬片，也可以是冷冻组织切片．石蜡包埋组织切片不适用于该技术。LscM主要使用直接或间接免疫荧光染色和荧光原位杂交技术。荧光标记的探针或抗体的质量将直接影响实验的结果。
第六节核酸原位杂交技术
原位杂交(in situ hVbridizacion，IsH)是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合以检测和定位核酸的技术。它是用标记了的已知序列的核苷酸片段作为探针(probe)，通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定靶DNA或RNA的存在。IsH的生物化学基础是DNA变性、复性和碱基互补配对结合。根据所选用的探针和待检测靶序列的不同，有I)NA—DNA杂交、DNA—RNA杂交和RNA—RNA杂交。
(一)探针的选择和标记
用于原位杂交的探针有双链cDNA探针、单链cDNA探针、单链cRNA探针以及合成的寡核苷酸探针等。一般而言，探针的长度以50～30(3bp为宜，用于染色体原位杂交的探针可为1．2～1．5kb。探针标记物有放射性和非放射性之分，前者如放射性核素，H、。、印等，这类探针的敏感性高，但有半衰期及放射性污染，成本高且耗时等缺陷，故其使用受到限制；非放射性探针标记物有荧光素、地高辛和生物素等．尽管其敏感性不如放射性标记探针，但因其性能稳定、操作简便、成本低和耗时短等长处，正越来越广泛地得到应用。双链cDNA探针的标记可用缺口平移法或随机引物法；单链cRNA探针可通过转录进行标记；合成的寡核苷酸探针可用5’末端标记法，即加尾标记法。(二)原位杂交的主要程序
原位杂交的实验材料可以是常规石蜡包埋组织切片、冷冻组织切片、细胞涂片和培养细胞爬片等。主要程序包括杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理一清洗和杂交体的检测等。操作中应注意的问题有：①对DNA—RNA杂交和RNA—RNA杂交．需进行灭活RNA酶处理，包括用0．5％o的二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocal-bonate，【)EPC)水配制有关试剂和160～180℃烘烤实验用器皿等；当使用双链cDNA探针和(或)待测靶序列是DNA时，需进行变性处理使DNA解链；②杂交温度应低于杂交体的解链温度(Tm)25~(2左右；③对照实验：原位杂交远较免疫组化染色复杂，影响因素颇多，故对照实验必不可少，有组织对照、探针对照、杂交反应体系对照和检测系统的对照等，可根据具体情况选用。
(三)荧光原位杂交(flLlorescence in situ hVbr_dization。FISH)可以用直接法或间接法进行FIsH。直接法FIsH是以荧光素直接标记已知DNA探针，所检测的靶序列为DNA。间接法：FISt{是以非荧光标记物标记已知DNA探针．再桥连一个荧光标记的抗体。用于FIsH的探针有不同的类型，如重复序列探针、位点特异性探针和全染色体探针等，目前已有大量商品化的荧光标记探针，使F：[St{技术得到越来越广泛的应用。FIsH的实验材料可以是问期细胞、分裂中期的染色体，也可以是冷冻或石蜡切片组织(图17—6)。
(四)原位杂交技术的应用
原位杂交可应用于：①细胞特异性mR．NA转录的定位．如基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②受感染组织中病毒DNA／RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒DNA(图17—7)和巨细胞病毒DNA的检测；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；④基因在染色体上的定位；⑤染色体变化的检测，如染色体数量异常和染色体易位等：⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断等。原位杂交与免疫组化染色技术相比较．IHc使用的是抗体．其检测对象是抗原，机制是抗原一抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；IsH使用的是探针．遵循碱基互补配对的原则，与待检测的靶序列结合，是DNA或转录(mRNA)水平的检测。两者均有较高的敏感性和特异性，但IsH更容易受到外界因素的影响。
第七节原位多聚酶链式反应技术
原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应(polymerase chain reactl’orl，PcR)技术的一部分。PCR．是在体外经酶促反应将某一特定DNA序列进行高效、快速扩增，它可将单一拷贝或低拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规方法可检测的水平，但不能进行组织学定位。原位PcR(in situ PcR)技术是将PcR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻切片或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位核酸的技术。
(一)原位PCR技术方法
原位PcR技术有直接法原位PcR、间接法原位PcR、原位反转录PcR(in situ re—vel_se transcl’iption—PcR，in Sl‘ttl RT—PcR)和原位再生式序列复制反应(self—sLtstained se—quence replication reactl‘orl，3SP．．)等方法，其中应用相对较为广泛的是间接法原位PcR。其主要程序有：组织固定、预处理(如蛋白酶K和RNA酶消化)、原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增产物进行检测，使该方法的特异性较直接法原位PCIR．．高。
(二)原位PCR技术的应用及存在的问题
原位PcR技术可对低拷贝的内源性基因进行检测和定位，在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变、基因重排等的研究和观察。还可用于外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病原的基因检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核杆菌、麻风杆菌基因的检测等，在临床上还可用于对接受了基因治疗的患者体内导入基因的检测等。
从理论上说，原位PcR是一个较完美的技术，兼具较高的敏感性和基因的细胞内定位功能，但目前该技术方法还欠完善，主要表现在以下几个方面：①特异性不高，尤其是假阳性问题。可能产生假阳性的原因有引物扩增序列的弥散、引物与模板的错配等。为提高其检测结果的特异性，必须设计严格的实验对照，包括已知阳性和阴性对照、引物对照、PcR反应体系对照以及用DNA酶和RNA酶处理后样本的阴性对照等；②技术操作复杂，影响因素过多；③需要特殊的设备，即原位PcR仪，价格昂贵，加之技术方法上存在的问题等，短时间内还难以在国内大面积推广使用，但有一定的潜在应用前景。
第八节流式细胞技术
流式细胞技术(now cytomerc、r，FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选的技术。流式细胞技术是免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等综合利用的技术。(一)流式细胞仪的基本结构和工作原理 ．
流式细胞仪由三部分构成：①传感系统，包括样本递送系统、样品池、监测系统、电子传感器和激光源等；②计算机系统；③电路、光路和水路系统，有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒在稳定的液流推动装置作用下，依次通过样品池，流速可达9米／秒，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图、直方图和假i维结构图像进行分析(图17—8)。(二)样本制备的基本原则
用于FcM的样本是单细胞悬液。可以是血液、悬浮细胞培养液和各种体液，如胸水、腹水、脑脊液，新鲜实体瘤或石蜡包埋组织的单细胞悬液等。样本制备基本原则是：①保持各种体液和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本的制备和检测；②针对不同的细胞样本进行适当的洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使黏附的细胞彼此分离而成单细胞状态；③对新鲜实体瘤组织可选用或联合使用酶消化法、机械打散法和化学分散法来获得有足够细胞数量的单细胞悬液。常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原酶等；④对石蜡包埋组织应先切成若干40～50斗m厚的石蜡切片，经二甲苯脱蜡至水化，再选用前述方法制备单细胞悬液：⑤单细胞悬液的细胞数应不少于10‘。(三)流式细胞术的应用
流式细胞仪具有精密、准确、快速和高分辨力等特性，具体表现在以下几个方面：①其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2％以下；②能准确地进行DNA倍体分析：③借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；④快速进行细胞分选和细胞收集。流式细胞术在医学基础研究和临床检测中有多方面的应用，如外周血细胞的免疫表型测定和定量分析；某一特定细胞群的筛选和细胞收集；细胞多药耐药基因的检测；癌基因和抑癌基因的检测：细胞凋亡的定量研究；细胞毒功能检测以及细胞内某些蛋白质和核酸的定量分析等。应注意的是单细胞悬液样本的质量直接影响FcM检测结果，一般而言，新鲜细胞或组织样本优于已固定的组织样本。
第九节 图像分析技术
病理图像分析包括定性和定量两个方面，以往受技术所限，常规病理形态学观察基本上是定性的。缺乏精确的更为客观的定量标准和方法。图像分析技术(inaage analysis，IA)的出现弥补了这个缺点。随着电子计算机技术的发展，形态定量技术已从二维空问向三维空间发展。在肿瘤病理学方面，图像分析技术主要用于核形态参数的测定(如核直径、周长、面积、体积等)、肿瘤的组织病理学分级和预后判断等，也可用于DNA倍体的测定和显色反应(如免疫组化)的定量等。
第十节 比较基因组杂交技术
比较基因组杂交(comparative genomic：hybridization，cGH)是近年来发展起来的一种分子细胞学技术，它通过单一的一次杂交可对某一肿瘤全基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。其基本原理是：用不同的荧光染料分别标记肿瘤组织DNA和正常细胞或组织的DNA，制成探针，并与正常人的分裂中期染色体进行共杂交，通过检测染色体上显示的肿瘤组织与正常对照组织不同的荧光强度，来反映整个肿瘤基因组DNA表达状况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究(图17—9)。
CGf{技术的优点是：①实验所需样本DNA量较少，做单一的一次杂交即可检查肿瘤全基因组的染色体拷贝数量的变化；②该方法不仅适用于外周血、培养细胞和新鲜组织样本的研究，还可用于甲醛固定石蜡包埋组织样本的研究，也可用于因DNA量过少而经PcR扩增的样本研究。尽管cGH是研究DNA拷贝数量变化的有力工具，但也有其局限性：一是用CGt{技术所能检测到的最小的DNA扩增或缺失是3～5Mb，故对于低水平的19NA扩增和小片段的缺失就会漏检；二是在染色体的拷贝数量无变化时，cGH技术不能检测出平行染色体的易位。
第十一节 生物芯片技术
生物芯片技术(1~iochip techniclue)是近年来发展起来的生物医学高新技术，包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片等。(一)基因芯片(geRe chip)基因芯片又称I)NA芯片(DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序、高密度地(点与点间距一般小于5 0【)¨m)排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，形成基因芯片。一套完整的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统等。1．基因芯片的分类和工作原理按基因芯片的功能用途可将其分为三类：表达谱基因芯片、诊断芯片和检测芯片，表达谱基因芯片主要用于基因功能的研究；后两者可用于遗传病、代谢性疾病和某些肿瘤的诊断、病原微生物的检测等。基因芯片检测的基本原理(图17—10)是：用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mR_NA分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA片段进行杂交、洗涤，然后用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织的表达差异。
2．基因芯片的应用 基因芯片技术可用于生命科学研究的各个领域，在基础研究方面有基因表达谱分析、肿瘤基因分型、基因突变的检测、新基因的寻找、遗传作图和重测序等；在临床上可用于抗生素和抗肿瘤药物的筛选和疾病的诊断等方面。利用基因芯片技术，人们可以大规模、高通量地对成千上万个基因同时进行研究，从而解决了传统的核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测效率低等问题。通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析方法使该技术具有广阔的应用前景。应用基因芯片技术要求实验材料是从新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA，对外周血或培养细胞样本的研究相对容易．对实体瘤的研究受到一定限制。
(二)蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)又称蛋白质微阵列(protein microarray)，它是继基因芯片之后发展起来的对基因功能产物表达水平进行检测的技术。蛋白质芯片也是在一个载体上高密度地点布不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一起与芯片上的蛋白质竞争结合，利用荧光扫描仪测定芯片上各点阵的荧光强度，再经计算机分析计算出待测样本结果。随着蛋白质芯片制作技术的不断完善。检测容量已达一万三千多个点，并实现了整个过程全自动化检测，具有高效率、低成本的特点，尤其适合于蛋白表达的大规模、多种类筛查，并能用于受体一配体、多种感染因素的筛查和肿瘤的诊断。
(三)组织芯片
组织芯片(tl。SSl】e chip)又称组织微阵列(t1‘SSLle micrOaIT』ay)是由Kononen等在1998年首次提出这一概念。组织芯片是将数十个至数百个小的组织片整齐地排列在某一载体上(通常是载玻片)而成的微缩组织切片。组织芯片的制作流程主要包括组织筛选和定位、阵列蜡块的制作和切片等步骤r冈17—
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组织芯片的特点是体积小、信息含量大，并可根据不同的需求进行组合制成各种组织芯片，能高效、快速和低消耗地进行各种组织学的原位研究和观察，如形态学、免疫组织化学、原位杂交和原位PcR等，并有较好的内对照及实验条件的可比性。在科研工作中可单独应用或与基因芯片联合应用，用于基因及其蛋白表达产物的分析和基因功能的研究；用于基因探针的筛选和抗体等生物制剂的鉴定；组织芯片还可作为组织学和病理学实习教材、外科病理学微缩图谱等。
第十二节 生物信息学技术
生物信息学(t)ioirl~oImadcs)是一门研究生物系统中信息现象的新兴的交叉学科．涉及生物学、数学、物理学、计算机科学和信息科学等多个领域。随着生物科学和技术的不断发展和基因组研究的不断深入，生物分子数据迅速增长，数据量巨大，其中既有生物分子序列的信息，又有结构和功能的信息；既有生命本质信息(如基因)，又有生命表象信息(如基因表达信息)，并且数据之间存在着密切的联系。生物信息学以计算机、网络为工具，以数据库为载体，利用数学和信息科学的理论、方法和技术研究生物大分子，建立各种计算模型，对实验生物学中产生的大量生物学数据进行收集、存储、集成、查询、处理及分析，揭示蕴含在这些数据中的丰富内涵，发现生物分子信息的组织规律，从而掌握复杂的生命现象包括生命起源、生物进化以及细胞、器官和个体的发生、发育、病变、衰亡的规律和时空联系。20世纪90年代，在人类基因组计划的推动下。生物信息学得以迅猛发展。人类基因组计划产生的生物分子数据是生物信息学的源泉．而人类基因组计划所需要解决的问题则是生物信息学发展的动力。
生物信息学的研究范畴是以基因组DNA序列的信息分析作为源头，分析基因组结陶，寻找或发现新基因，分析基因调控信息，并在此基础上研究基因的功能，模拟和预测蛋白质的空间结构，分析蛋白质的性质以及蛋白质结构与功能之问的关系，为基于靶分子结构的药物分子设计和蛋白质分子改性设计提供依据。当前，生物信息学已在理论生物学领域占据了核心地位。’
生物信息学的主要任务是研究生物分子数据的获取、存储和查询，发展数据分析方法．主要包括三个方面：①生物信息的收集、存储、管理与提供：建立生物信息数据库是生物信息学的重要内容，提供数据查询、搜索、筛选和序列比对，并为信息分析和数据挖掘打下基础。目前，分子生物学的三大核心数据库——GenBank核酸序列数据库、SWISS—PROT蛋白质序列数据库和PDB生物大分子结构数据库，不仅已成为全世界分子生物学和医学研究人员获取生物分子序列、结构和其他信息的基本来源，而且是发表自己序列或结构测定结果的重要媒体；②生物学数据的处理和分析：如基因组序列分析、基因表达数据的分析与处理。通过数据分析，发现数据之间的关系，认识数据的本质，并在此基础上．了解基因与疾病的关系，了解疾病产生的机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。帮助确定新药的作用靶点和作用方式，设计新的药物分子，为进一步的研究和应用打下基础；③生物学数据的有效利用：开发研制管理分析数据的新工具和实用软件，为生物信息学的具体应用服务。如与大规模基因表达谱分析相关的算法和软件研究，基因表达调控网络的研究．与基因组信息相关的核酸、蛋白质空间结构的预测和模拟，以及蛋白质功能预测的研奔等一牛物分子信．息处理流程见．图17—12。
随着现代生物技术的进展，特别是生物芯片技术、蛋白质二维凝胶电泳技术和质谱技术、蛋白质结构测定技术的快速发展，这类新形式的生物学实验数据的信息挖掘已纳人生物信息学的研究范畴，从而大大扩展了生物信息学的工作内容。后基因组时代的生物信息学技术籽为基因组功能预测、透视基因相互作用及其机制、利用生物分子的信息参与创新药物的设计、生物学虚拟实验模型的构建等提供强大的技术支撑。
