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酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮代谢物
摘要建立养殖虾类中 AOZ残留 ELISA筛选方法。方法: 酸性条件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去杂质后进行 ELISA分析。结果: 方法最低检测限为 013 Lg/kg, 向样品中添加浓度为 015、110和 310Lg/kg3个梯度标准品溶液时, 平均回收率范围为 9017% ~ 9519%, RSD 为 4124% ~ 5142%。结论: 实验证明该方法适合养殖虾类中 AOZ残留筛选。
关键词：虾肉;呋喃唑酮代谢物;ELISA
一、前言
呋喃唑酮（FZD）,又名痢特灵,是一种广谱抗菌药物，属于硝基呋喃类药物，是人工合成的化学药。常被掺放在饲料中，用于水产品养殖传染病的预防与治疗[1]。药代动力学研究表明，呋喃唑酮在动物体内的代谢非常快，现已明确此类抗生素的原型在体内 4 d 后，就已完全分解成其代谢物，所以分析呋喃唑酮时，只能分析其代谢物[2]。经研究表明，呋喃唑酮的代谢物中有相当数量是以其完整侧链 3-氨基-2-恶唑烷酮即 AOZ 与蛋白结合的残留物形式存在, AOZ 进一步代谢可产生具致癌、致突变作用的羟乙基肼[3]，因此检测呋喃唑酮代谢物(AOZ)的残留更具有现实意义。呋喃唑酮在畜产品和水产品中的残留，通过食物链传递给人类,会使人体受到损害。另外,其作为人畜共用药，长期微量摄入易使人体产生抗药性，导致呋喃唑酮药物失去医疗功效[4]。
1990 年 7 月欧盟颁布 2377/90/EEC 条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为 A 类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为 1.0 μg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995 年起欧盟、日本、美国等都开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼，虾及禽类进行残留检测[5]。同许多国家一样，我国农业部制订的 NY5070-2002《无公害食品水产品中鱼药残留限量》及 GB18406.4-2001《无公害水产品安全要求》规定，水产品中不得检出呋喃唑酮，同时禁 止在饲料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中残留的监测方法主要有高效液相色谱法[7-8]、酶联免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶联免疫法已受到广泛重视。本试验主要 使用酶联免疫法对出口虾中呋喃唑酮代谢物AOZ 的残留做快速检测。
福建省诏安县海利水产有限公司，是一家集水产品加工、销售、研究、开发和养殖于一体的大型出口企业。该公司于2005年引进投建，厂房和生产布局按照《出口食品生产企业卫生注册登记管理规定》和美国FDA法规及欧盟指令进行设计建造，厂区占地面积八万平方米，全封闭配套中央空调的水产加工车间二万平方米，生产车间配套高效臭氧杀菌设施，制冷水机和大型制冰机等各种先进加工设备，冻库储存能力达6000吨，同时配套建设大型对虾养殖场及虾苗孵化场，拥有一支高素质员工队伍，年加工生产水产品15000吨以上，产品近二十种，主要有冻生虾、冻熟虾、冻面包虾、寿司虾、冻鱿鱼、冻罗非鱼等。公司秉承共同发展的目标，不断完善质量管理体系，执着追求品质,先后获得了《卫生注册证书》、《输美水产品HACCP验证证书》，2005年11月通过了BRC认证，2006年1月通过了ISO9001认证，2008年通过了欧盟相关质量认证，产品获得了国外消费者的肯定和喜欢，远销日本、美国、加拿大、墨西哥和香港等国家和地区，在国外赢得了市场。公司自建成投产以来，企业迅速发展壮大。
1材料与方法
1.1
样品
均来自福建省海利水产有限公司。
1.2
主要仪器及设备
MK3 型酶标仪: Thermo 公司；Scientz-10 型均质机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 电子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；4K15 型高速冷冻离心机：Sigma公司；HH-w600s 恒温水箱：山东鄄城新科教学仪器厂；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。
1.3
试剂与溶液
呋喃唑酮代谢产物-AOZ 试剂盒：北京望尔生物技术有限公司；灵敏度为 0.125 μg/kg，包括：AOZ 标准溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、浓缩缓冲液、浓缩提取/洗涤液、衍生试剂、浓缩酶标记物、底物溶液、反应终止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。
1.4方法
1.4.1
样品处理
虾去头去壳，取可食用部分，制成均质物。
1.4.2
样品制备
1）称取 1 g 已均质的样品于 50 mL 离心管中，依次加入 4 mL 超纯水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生试剂，漩涡振荡 1 min。置 37 ℃的恒温培养箱中温育，静置过夜（约 16 h）。
2）加入 5 mL 原倍缓冲液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振荡混合约 1 min。
3）离心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯层）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮气吹干。
4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先将残留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振荡 1 min。
5）将玻璃试管置于 80℃～100℃热水浴中约 3min，以减少水相与有机相间的乳化现象。6）离心 10 min（3 000 r/min），吸去上层液（正己烷），弃掉，再吸取下层液（水层）备用。
1.4.3测定
1）将 AOZ 试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。
2）取出相应数量的微孔，各个标准液和待测样品各做 2 个平行样，做好记录。
3）于适当的微孔中分别加入 50 μL 标准溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。
4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前处理的样品溶液。
5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀释的酶标记物。
6）轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温（25 ℃）下避光静置温育 50 min。
7）微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗 3 次。
8）最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，轻敲盘子四周，使其充分混合。
10）于室温（25 ℃）下避光静置温育 30 min。
11）于每一微孔中加入 100 μL 反应终止液。
12）用酶标仪于波长 450 nm 下判读。
1.5
数据处理
1）计算（B/B0）×100 值。用样品和标准溶液吸光度值（B）除以零标准吸光度值（B0）再乘以 100。
2）以（B/B0）×100 值为纵坐标，以样品浓度的对数值为横坐标，做标准对数曲线。
3）根据每个样品的 B/B0值就可以从曲线上读出相对应样品的浓度
2结果
2.1
标准曲线的绘制
AOZ 标准品的 ELISA 检测结果见表 1。
2.4
试验过程中的注意事项
1）A回温试剂（20℃-24℃）。B恒温孵育，避免光线照射。
2）、将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。
3）加入50ul标准或处理好的样品液到各自的微孔中，每个孔加入样品或标准时注意更换移液器的吸头。
4)加入50ul酶标记物溶液（红帽）到每一个微孔底部，充分混合。
5)加入50ul抗体溶液（黑帽）到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育1小时，覆盖上薄膜。
6)倒出孔中的流体将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250ul样品洗涤缓冲液充入孔中，重复两次。
7)加入100ul基质/发色剂到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟。
8）加入100ul反应终止液到每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取吸光值。
9）试剂盒内容物要完全回稳后再进行操作，否则，会出现吸光值偏低或没有吸光值。
10）温浴时若室温太低或太高，请适当延长或缩短温浴时间，或直接在恒温培养箱中进行。
11）加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。
12）加样和洗板过程中，要避免微孔间的相互污染。
13）整个试验过程中，勿使微孔干燥。
结论
本试验用酶联免疫法检测了海利水产有限公司中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留状况，结果表明绝大多数的水产品符合规定，只有极少数部分有残留。用酶联免疫法对虾肉呋喃唑酮代谢物 AOZ 残留进行测定，操作简易，不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，作为一种快速筛选手段，在食品工业中有着广阔的推广应用前景，尤其在水产品出口企业中，但酶联免疫试剂盒的价格将是最大的制约因素。
参考文献：
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